HPLC法测定三氟柳的含量及有关物质

郭海波，郭旭光，查 岭

(1.河南省药品审评认证中心，河南 郑州 450004；2.河南省食品药品检验所，河南 郑州 450003；3.周口市中心医院，河南 周口 466000)

三氟柳(Triflusal)是一种抗血小板凝聚剂，能通过不可逆地抑制血小板环氧化酶，而减少血栓素合成酶的生物合成，从而抑制血小板的聚集。三氟柳在临床上广泛应用于预防中风和心肌梗塞，其疗效确切、安全可靠[1，2]。自1981年起，三氟柳先后在西班牙、巴西、墨西哥、秘鲁等国家上市，我国尚未进口该产品。关于其检测方法的报道也非常少。为了更有效地控制三氟柳的质量，作者建立了测定三氟柳含量及有关物质的HPLC方法。

1 实验

1.1 试剂与仪器

三氟柳原料药(批号：20100501、20100502、20100503)，常州莱恩化工有限公司；三氟柳对照品(原料药精制，纯度99.96%)；乙腈和甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

Agilent 1100型高效液相色谱仪，G1314A VWD型检测器，Agilent ChemStation 工作站；Sartorius BP211D型电子天平。

1.2 方法[3,4]

1.2.1 色谱条件与系统适用性考察

色谱条件：采用Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，进样量10 μL，流速1.0 mL·min-1。

首先称取三氟柳对照品适量，用流动相制成浓度为1 mg·mL-1的溶液，在200～400 nm波长处扫描，绘制紫外吸收光谱图，选择适宜的检测波长；然后从不同配比的甲醇-水、乙腈-水系统中选择适宜的流动相；最终确定适宜的色谱条件。后续实验均在此色谱条件下进行。

1.2.2 线性关系考察

称取三氟柳对照品20.25 mg，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。分别精密量取贮备液1 mL、2 mL、5 mL、7 mL、10 mL置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，浓度分别为0.081 mg·mL-1、0.162 mg·mL-1、0.41 mg·mL-1、0.567 mg·mL-1、0.81 mg·mL-1，进样测定峰面积。以三氟柳浓度为横坐标(x，mg·mL-1)、峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

1.2.3 精密度实验

取1.2.2中浓度为0.41 mg·mL-1的溶液，连续重复进样6次，测定峰面积。

1.2.4 重复性实验

精密称取三氟柳原料药(批号20100501)约10 mg，连续称定6份，分别置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取三氟柳对照品约10 mg，同法配制，作为对照品溶液。分别精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法由峰面积计算样品三氟柳含量。

1.2.5 溶液稳定性实验

精密称取三氟柳原料药(批号20100501)10.18 mg，置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。室温放置，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h测定峰面积。

1.2.6 回收率实验

精密称取同一批已知含量的三氟柳原料药(批号20100501)约8 mg、10 mg、12 mg各3份，置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取三氟柳对照品约10 mg，同法配制溶液，作为对照品溶液。分别精密量取10 μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法由峰面积计算测得量及回收率。

1.2.7 检测限测定

取1.2.2中浓度为0.081 mg·mL-1的溶液，用流动相逐级稀释成一系列浓度的溶液，分别精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.2.8 专属性实验

精密称取三氟柳原料药(批号20100501)约20 mg，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为样品贮备液。按下述方法制备供试液，进样测定HPLC色谱图。

(1)酸破坏实验：取样品贮备液5 mL，加入1 mol·L-1的盐酸溶液1 mL，静置1 h，加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液。

(2)碱破坏实验：取样品贮备液5 mL，加入1 mol·L-1的氢氧化钠溶液1 mL，静置1 h，加入1 mol·L-1盐酸溶液1 mL，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液。

(3)氧化破坏实验：取样品贮备液5 mL，加入30%H2O2溶液1 mL，静置1 h，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液。

(4)高温破坏实验：取样品贮备液5 mL，置水浴加热2 h，冷却，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液。

(5)光照破坏实验：取样品贮备液5 mL，置4500 Lx强光下照射3 d，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液。

1.2.9 样品三氟柳含量及有关物质测定

精密称取三氟柳原料药约10 mg，置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另精密称取三氟柳对照品约10 mg，置25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

(1)三氟柳含量测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法由峰面积计算三氟柳含量。

(2)有关物质测定：精密量取对照溶液10 μL注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰的峰高约为记录仪满量程的20%～25%，记录色谱图；再精密量取供试品溶液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，以不加校正因子的主成分自身对照法由峰面积计算样品中有关物质的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

实验发现，三氟柳在224 nm和278 nm波长处有最大吸收，因224 nm接近溶剂乙腈的末端吸收区域，故选择278 nm作为检测波长。

实验发现，以甲醇-水、乙腈-水作流动相时，三氟柳主峰峰形较宽，拖尾，与杂质峰分离度较差。通过改变水相的酸性并加入四氢呋喃调节流动相的极性，使得三氟柳主峰峰形对称，理论板数高，主峰与各杂质及降解产物达到基线分离，经方法学验证结果满意。

最终确定的色谱条件为：采用Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，0.3%磷酸水溶液-乙腈-四氢呋喃(60∶30∶10)为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长278 nm。在上述条件下，理论板数以三氟柳峰计不低于3000，主峰与各杂质峰能达到基线分离，分离度大于2。

2.2 线性关系

由标准曲线拟合线性回归方程为：y=2225.801x-54.059，R=0.9992，表明三氟柳浓度在0.081～0.81 mg·mL-1范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.3 精密度

精密度实验测得样品的峰面积分别为826.94、829.86、823.27、831.01、821.95、825.06，RSD(n=6)为0.44%，表明方法的精密度良好。

2.4 重复性

重复性实验测得三氟柳的平均含量为99.18%，RSD(n=6)为0.28%，表明方法的重复性良好。

2.5 溶液稳定性

稳定性实验测得样品的峰面积分别为847.83、852.47、845.76、844.85、839.17、843.28、836.87，RSD(n=7)为0.62%，表明本品溶液在12 h内稳定，能够满足检测需要。

2.6 回收率

回收率实验结果见表1。

表1 回收率实验结果

由表1计算3个浓度下平均回收率为98.25%，RSD(n=3)为1.11%。

2.7 检测限

实验发现，当溶液浓度为162 ng·mL-1时，色谱峰信噪比为3∶1，表明三氟柳的最低检测限为1.62 ng。

2.8 专属性

三氟柳降解产物的HPLC色谱图见图1。

a.酸破坏样品 b.碱破坏样品 c.氧化破坏样品 d.高温破坏样品 e.光照破坏样品

由图1可知，供试液经酸、碱、氧化、高温、光照破坏实验产生的降解产物峰能与三氟柳峰有效分离，分离度均大于1.5，表明方法的专属性良好。

2.9 样品三氟柳含量及有关物质(表2)

表2 三氟柳含量及有关物质测定结果

3 结论

采用HPLC法测定三氟柳的含量及有关物质。色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.3%磷酸水溶液-乙腈-四氢呋喃(60∶30∶10)，流速1.0 mL·min-1，检测波长278 nm。结果表明，三氟柳与各杂质及降解产物分离良好，在0.081～0.81 mg·mL-1范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系(R=0.9992)，平均回收率为98.25%，RSD为1.11%，最低检测限为1.62 ng。该方法操作简便、灵敏、准确度高，可用于三氟柳的质量控制。

[1]McNeely W，Goa K.Triflusal[J].Drugs，1998，55(6)：823-833.

[2]Murdoch D，Plosker G L.Triflusal：A review of its use in cerebral infarction and myocardial infarction，and as thromboprophylaxis in atrial fibrillation[J].Drugs，2006，66(5)：671-692.

[3]European Pharmacopoeia Commission Strasbourg:European Directorate for the Quality of Medicine Health Care EP7.0[S].2010：3137-3138.

[4]国家药典委员会.中国药典(二部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录194-195.