荷叶总生物碱清除氧自由基作用的研究

肖桂青，田 云，卢向阳

(湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

自由基是生物体在生命活动过程中产生的中间产物，适量的自由基对细胞的分化、生长、消炎解毒起着积极的作用；但过量则会在分子水平、细胞水平乃至器官水平造成机体损伤，例如引起蛋白质变性、酶失活、多糖降解、DNA断裂、生物膜结构损伤、细胞解体乃至机体病变和死亡。现代医学研究表明，人体衰老、肿瘤发生、辐射致癌、心脑血管疾病等过程均与自由基有关[1]。

荷叶(NelumbonucifereaGaertn.)，睡莲科植物，主产于湖南、湖北、浙江、江苏等地。荷叶营养丰富，成分复杂，除含有植物所共有的碳水化合物、脂质、蛋白质、无机盐和水分外，还含有多种生物碱类、黄酮类、精油、鞣质、维生素C、酒石酸、枸橼酸、苹果酸、草酸等，其中生物碱和黄酮类化合物是荷叶主要的生物活性和生理功能成分[2]。

有报道采用电子自旋共振法或化学发光法研究荷叶水提液或醇提液对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除效果，结果表明荷叶提取液对自由基有较强的清除能力[3～5]。但对荷叶中某类化学成分清除自由基能力的研究相对较少。

作者在此应用微弱化学发光法测定荷叶总生物碱对氧自由基的清除作用，并与荷叶水提液、荷叶醇提液及维生素C进行比较，为进一步明确其化学成分与生理活性提供科学依据，同时为多途径开发利用荷叶资源提供新思路。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

荷叶采自长沙东湖；荷叶总生物碱，经微波辅助热回流法提取、D-101型大孔吸附树脂纯化、冷冻干燥得到。

邻苯三酚、1，10-菲啰啉、维生素C(VC)、Na2CO3、NaHCO3、30%H2O2、CuSO4、硼酸、硼砂等均为分析纯，鲁米诺为色谱纯。

85-1型恒温磁力搅拌器，金坛市富华电器有限公司；AR3130型电子精密天平，奥豪斯国际贸易有限公司；微量可调移液器，芬兰雷勃公司；BPCL-2-G型微弱发光测量仪，中国科学院生物物理研究所。

1.2 方法

1.2.1 荷叶总生物碱溶液的制备

取荷叶总生物碱固体适量，用50%乙醇溶解，配制成不同浓度的溶液。

1.2.2 荷叶水提液的制备

称取10 g荷叶粉，用100 ℃热水提取4 h，过滤，离心，真空浓缩至50 mL。

1.2.3 荷叶醇提液的制备

称取10 g荷叶粉，用70%乙醇回流提取4 h，过滤，离心，真空浓缩至50 mL。

在样品池内依次加入一定浓度梯度的样品溶液(荷叶总生物碱、荷叶水提液、荷叶醇提液、VC)50 μL(以相应溶剂作对照)，然后加入1 mmol·L-1邻苯三酚10 μL、鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液(pH值10.2)940 μL，充分混匀后，立即启动化学发光反应，记录60 s内化学发光动力学曲线。

1.2.5 清除·OH能力的测定[6]

在样品池内依次加入一定浓度梯度的样品溶液(荷叶总生物碱、荷叶水提液、荷叶醇提液、VC)50 μL(以相应溶剂作对照)，然后加入1 mmol·L-1CuSO4溶液50 μL、1 mmol·L-11，10-菲啰啉50 μL、硼酸-硼砂缓冲溶液(pH值9.0)700 μL，充分混匀后，立即启动化学发光反应，记录60 s内化学发光动力学曲线。

1.2.6 清除H2O2能力的测定[6]

在样品池内依次加入一定浓度梯度的样品溶液(荷叶总生物碱、荷叶水提液、荷叶醇提液、VC)50 μL(以相应溶剂作对照)，然后加入15%H2O2溶液50 μL、鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液(pH值9.5)900 μL，充分混匀后，立即启动化学发光反应，记录60 s内化学发光动力学曲线。

1.3 清除氧自由基能力评价[6]

微弱化学发光法测定氧自由基清除作用时，一定范围内发光强度(CL)与氧自由基数量呈量效关系，因此可以用CL表示氧自由基的相对产生量。清除氧自由基的物质可以降低CL，根据CL的下降则可以评价物质清除氧自由基的能力。

一般用发光抑制率为50%时的浓度IC50来衡量样品对氧自由基的清除能力。IC50越小，表明样品清除氧自由基的能力越强；反之，IC50越大，表明样品清除氧自由基的能力越弱。

2 结果与讨论

2.1 荷叶总生物碱清除·能力

图1 荷叶总生物碱清除超氧阴离子的发光曲线

表1 不同浓度荷叶总生物碱清除超氧阴离子能力

2.2 荷叶总生物碱清除·OH能力

图2为不同浓度荷叶总生物碱清除·OH的发光动力学曲线。

图2 荷叶总生物碱清除羟基自由基发光曲线

从图2可以看出，不同浓度的荷叶总生物碱均可以使发光动力学曲线发生明显的变化，表现为发光峰值和发光曲线面积的降低，且降低程度与荷叶总生物碱浓度相关。荷叶水提液、荷叶醇提液、VC清除·OH的发光动力学曲线与此类似。

不同浓度荷叶总生物碱清除·OH能力见表2。

表2 不同浓度荷叶总生物碱清除羟基自由基能力

2.3 荷叶总生物碱清除H2O2能力

图3为不同浓度荷叶总生物碱清除H2O2的发光动力学曲线。

图3 荷叶总生物碱清除过氧化氢的发光曲线

从图3可以看出，不同浓度的荷叶总生物碱均可以使发光动力学曲线发生明显的变化，表现为发光峰值和发光曲线面积的降低，且降低程度与荷叶总生物碱浓度相关。VC清除H2O2的发光动力学曲线与此类似，无法测得荷叶水提液、荷叶醇提液清除H2O2的发光动力学曲线。

不同浓度荷叶总生物碱清除H2O2能力见表3。

表3 不同浓度荷叶总生物碱清除过氧化氢能力

2.4 清除氧自由基能力对比

几种供试物质清除氧自由基的能力见表4。

表4 荷叶提取物和VC清除氧自由基的能力

2.5 讨论

荷叶是一种药食兼用的中药，对疾病具有较好的疗效。目前，有关荷叶提取液抗氧化性的报道较多，但有关其中抗氧自由基的有效成分的筛选报道较少。本研究通过考察荷叶总生物碱、荷叶水提液、荷叶醇提液对3种主要氧自由基的专一清除能力，证实其有效活性成分生物碱能通过抑制或清除氧自由基特别是·OH，来防止氧化损伤。荷叶提取液中因含有生物碱类成分，对·OH的清除能力较强。在众多的自由基中，·OH最活泼、对机体危害也最大[7，8]，因此，本研究为进一步分析荷叶提取液中的各种成分、筛选出抗氧自由基的有效成分及研究各成分间协同综合效应等提供了实验基础和依据。

3 结论

[1]赵晶，白云.自由基相关疾病研究进展[J].生物学教学，2003，28(4)：6-8.

[2]孔文琦，李严巍.荷叶活性成分及药理活性研究进展[J].中药研究与信息，2005，7(6)：22-24.

[3]余以刚，陈海光，曾庆孝.荷叶水提物清除自由基的ESR研究[J].中草药，2001，32(8)：693-695.

[4]陈海光，曾庆孝.荷叶功能成分的提取及其对自由基清除作用的研究[J].食品与发酵工业，2002，27(10)：34-38.

[5]肖华山，黄代青，傅文庆，等.荷叶对体外氧自由基的清除作用及其对果蝇寿命的影响[J].中国老年学杂志，1996，22(6)：373-375.

[6]田云.几种植物抗氧化剂制备、评价与应用初步研究[D].长沙：湖南农业大学，2004.

[7]Gutteridge J M C.Free radicals in medicine[J].BMJ，1994，309(6955)：678.

[8]Tabatabaie T，Vasquez-Weldon A，Moore D R,et al. Free radicals and the pathogenesis of type 1 diabetes：β-Cell cytokine-mediated free radical generation via cyclooxygenase-2[J].Diabetes，2003，52(8)：1994-1999.