胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

曹珊珊，牛卫宁，羊梦林，钦传光

(西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072)

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，又称高半胱氨酸，是一种含巯基的氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物。研究表明，Hcy是导致心脑血管疾病、糖尿病以及神经系统疾病的危险因素[1]，因此，快速准确检测Hcy含量方法的建立，对基础研究和临床诊断都有非常重要的意义。

目前，同型半胱氨酸最主要的检测方法包括高效液相色谱法、荧光偏振免疫法、毛细管电泳-质谱联用法以及电化学法，这些检测方法均存在测定程序复杂、耗时、样品需要预处理以及测试仪器价格昂贵等弊端[2～5]。因此，本实验室拟建立一种通过酶催化测定Hcy的方法，该方法具有快速、方便、灵敏、精确的特点。反应原理如下：Hcy和L-丝氨酸在胱硫醚β-合酶(Cystathionineβ-synthase，CBS)催化下生成L-胱硫醚(L-Cystathionine)，L-胱硫醚又经过胱硫醚β-裂解酶(Cystathionineβ-lyase，CBL)催化生成丙酮酸，丙酮酸在碱性条件下与2,4-二硝基苯肼反应生成棕红色产物，利用分光光度计在520 nm下测定吸光度值即可得到丙酮酸含量[6]，从而计算出样品中Hcy的浓度。

因此，大量表达和纯化CBS和CBL并对其性质进行研究是建立酶催化法测定Hcy浓度的关键，本实验室前期已经对CBS的表达、纯化以及性质进行了系统研究。作者在此构建了高效表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)，一步亲和层析纯化得到CBL，并建立了一种新的CBL酶活性检测方法，同时对重组CBL的酶学性质进行了研究，为酶催化测定Hcy方法的建立奠定了基础。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌种和试剂

大肠杆菌E.coliK12、E.coliDH5α、E.coliBL21，自行保存。质粒pETDuet-1，Novagen公司；质粒DNA抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒，Omega公司；T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和各种限制性内切酶、蛋白Marker，TaKaRa公司；L-胱硫醚标准品，Sigma公司；HisTrap Fast Flow(1 mL)预装柱，GE公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.2 培养基

LB培养基：0.5% 酵母粉，1%蛋白胨，1%氯化钠，氨苄青霉素(Ampicillin)终浓度为50 μg·mL-1。

1.2 方法

1.2.1 重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)的构建

以大肠杆菌E.coliK12的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得CBL基因片段，上下游引物分别为：5′-CTCGGGATCCGCGGACAAAAAGCTTG-ATACTC-3′和5′-CAGTGCGGCCGCTACAATTCGCGCAAAACCGG-3′。

PCR 反应条件为：95 ℃ 变性5 min；95 ℃ 60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 90 s，循环25次；72 ℃延伸10 min。然后用BamHI和NotI双酶切经过胶回收的CBL基因和质粒pETDuet-1，连接酶切后片段构建重组质粒pETDuet-1-CBL，将重组质粒转化到E.coliDH5α感受态细胞中进行测序，测序正确后将重组质粒转化到E.coliBL21感受态细胞中，获得重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)。

1.2.2 重组CBL的表达

将培养过夜的重组大肠杆菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)按1∶100比例接种到500 mL含有50 μg·mL-1氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃、180 r·min-1培养至菌液OD600值为0.4～0.6，加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG于30 ℃诱导9 h，使菌体生长达到稳定期，再于4 ℃、6000 r·min-1离心10 min，获得的菌体悬浮洗涤后，离心收获菌体备用。

1.2.3 重组CBL的纯化

(1)粗提取

将上述离心收获的菌体重悬于破碎缓冲溶液(含50 mmol·L-1NaH2PO4、20 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1盐酸苯甲醚)中，在冰水浴中超声波(300 W，超声3 s，间隔8 s)处理1100 s破碎细胞，破碎液在4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min，上清液即为粗酶液。

(2)HisTrap Fast Flow亲和层析

将上述粗酶液加入到经平衡缓冲溶液(含50 mmol·L-1NaH2PO4、20 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1NaCl、2 mmol·L-1DTT)预平衡的HisTrap Fast Flow(1 mL)柱，流速1 mL·min-1洗脱至基线，然后用洗脱缓冲溶液(含50 mmol·L-1NaH2PO4、250 mmol·L-1咪唑、2 mmol·L-1DTT)进行洗脱，收集产物峰。酶液加甘油至终浓度为5%，-20 ℃保存备用。

1.2.4 酶活性测定

设置酶的反应体系为500 μL，在5 mmol·L-1的L-胱硫醚底物溶液(0.1 mol·L-1K2HPO4溶液配制，pH 值7.4)中加入适量酶液，37 ℃水浴保温20 min，然后煮沸2 min终止反应，在反应液中加入500 μL 1 mmol·L-1的2,4-二硝基苯肼和5 mL 0.4 mol·L-1的NaOH溶液，室温下静置30 min，在520 nm波长下测定吸光度值，以不加酶液的反应液为对照。以不同浓度的丙酮酸钠标准溶液和2,4-二硝基苯肼反应，绘制丙酮酸钠浓度和吸光度之间的标准曲线。

酶活力定义：在上述条件下，37 ℃、pH值7.4、1 h能催化产生1 μmol丙酮酸的酶量为1个酶活力单位(1 U)。

由于CBL能催化底物L-胱硫醚生成含有巯基的同型半胱氨酸，王伟伟[7]采用巯基检测试剂5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)来测定同型半胱氨酸的含量，从而测定CBL的活性。但研究发现该方法重复性较差，主要原因是产物同型半胱氨酸的巯基很容易被氧化从而影响测定结果，如果在反应体系中加入巯基保护试剂DTT和巯基乙醇等还原剂，还原剂中本身含有的巯基基团又会严重影响实验结果。

1.2.5 蛋白质含量测定

采用Bradford法测定蛋白质含量。绘制牛血清白蛋白标准曲线。

1.2.6 SDS-PAGE分析

十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用于分析蛋白质的分子量，分离胶浓度为10%，染色使用考马斯亮蓝R-250。

1.2.7 重组CBL的酶学性质考察

(1)最适温度及温度稳定性：在含有5 mmol·L-1的L-胱硫醚反应液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH值8.0)中加入适量纯化的CBL酶液，在不同反应温度下测定酶活性，研究温度对酶催化活性的影响。同时将酶液置于不同温度下保温5 h，测定剩余酶活性，研究该酶在不同温度下的稳定性。

(2)最适pH值及pH值稳定性：配制pH值5.0～10.0的反应液(含5 mmol·L-1的L-胱硫醚)，将一定量的酶液分别加入到不同pH值的反应液中，测定重组酶在不同pH值反应体系中的活性，研究pH值对酶催化活性的影响。在pH值5.0～10.0缓冲溶液中加入一定量的酶液，4 ℃下保温10 h，测定剩余酶活性，研究该酶在不同pH值条件下的稳定性。

(3)动力学常数的测定：配制浓度分别为20 mmol·L-1、10 mmol·L-1、5 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、1.25 mmol·L-1、0.625 mmol·L-1的L-胱硫醚溶液，分别与适量酶液在37 ℃下反应，计算反应速率，采用双倒数作图法确定重组CBL的反应速率常数KmL-cystathionine及最大反应速率VmaxL-cystathionine值。

2 结果与讨论

2.1 重组菌的构建和表达

以大肠杆菌E.coliK12基因组DNA为模板PCR克隆了1185 bp的CBL基因片断并进行测序，CBL基因编码395个氨基酸残基，然后将其连接至质粒pETDuet-1构建了重组质粒pETDuet-1-CBL，重组质粒BamHI和NotI双酶切鉴定结果如图1所示。

M.DNA Marker 1.CBL基因 2，3.pETDuet-1-CBL经Bam HI和Not I双酶切的产物

将重组质粒转入E.coliBL21感受态细胞构建了表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETduet-1-CBL)。重组菌在37 ℃下培养至OD600为0.4～0.6，加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG于30 ℃诱导9 h至稳定期，SDS-PAGE分析结果表明，目的蛋白分子量约40 kDa，这与大肠杆菌CBL分子量的理论计算值一致。可溶性CBL的表达量达18 mg·L-1，占到菌体可溶性总蛋白的23%，重组菌在该条件下表达的重组蛋白包涵体少，而在37 ℃、1 mmol·L-1IPTG诱导的条件下尽管蛋白表达量较大，但大部分为包涵体。因此，低温、低浓度的诱导剂有利于重组CBL的可溶性表达。

2.2 CBL的分离纯化

菌体超声破碎后的上清液，离心后上样到预平衡的HisTrap Fast Flow柱，目的蛋白直接吸附到柱上，用洗脱缓冲溶液进行洗脱，一步纯化得到CBL，酶活性回收率为71%，纯化的CBL纯度达到94%，单位酶活为134.6 U·mg-1，各步骤组分电泳结果见图2。

M.蛋白质分子量标准 1.诱导前菌体总蛋白 2.IPTG诱导后菌体总蛋白 3.IPTG诱导后菌体破碎后上清液 4.亲和层析纯化后的CBL溶液

此外，研究发现纯化后的CBL蛋白溶液经冻融后几乎全部聚集沉淀，这可能是由于蛋白质溶液冻融时产生的冰晶影响了蛋白质的三级结构所致。在纯化后的酶液中加入5%甘油，可以有效防止CBL溶液在冻融时发生聚沉。Laber等[8]也构建了表达大肠杆菌CBL的重组菌E.colipCS1，大规模发酵后通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析和Phenyl-Sepharose HP柱层析三步纯化，最终从10 L大肠杆菌发酵液中纯化获得150 mg CBL，但是并未对其酶学性质进行研究。

2.3 重组CBL的酶学性质

2.3.1 最适温度及温度稳定性

取一定量的CBL酶液分别在不同温度(25～55 ℃)下反应20 min，测定产物丙酮酸的生成量，计算不同温度下CBL的活性，结果如图3所示。

图3 温度对CBL酶活的影响

由图3可知，CBL的最适反应温度为35 ℃。温度在35～45 ℃时酶反应活性较高；当温度超过45 ℃时酶活性急剧下降，升至55 ℃时CBL活性降至最大酶活性的29.7%，这可能是由于温度超过45 ℃后重组CBL变性加快所致。

取一定量CBL酶液分别在20～50 ℃下保温5 h，测定产物丙酮酸的生成量，计算不同温度下CBL的活性，结果如图4所示。

图4 CBL在不同温度下的酶活稳定性

由图4可知，CBL在20～35 ℃下较稳定，随着温度的升高，稳定性逐渐下降，超过40 ℃时酶失活速度加快，当温度升至50 ℃时，相对酶活下降至32.2%。因此，在35 ℃下使用CBL酶催化反应最有效，且不宜将酶液长期放置在30 ℃以上环境。Gentry-Weeks等[9]由博德特氏菌(Bordetella)发酵得到的CBL在40 ℃以下较稳定。Alting等[10]从乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)中纯化的CBL在60 ℃以下比较稳定，60 ℃以上酶活性急剧下降，70 ℃时几乎完全失活。因此，来自博德特氏菌和乳酸乳球菌的CBL热稳定性均优于来自大肠杆菌的CBL，尤其是来自乳酸乳球菌的CBL具有很高的热稳定性。

2.3.2 最适pH值及pH值稳定性

取一定量CBL酶液分别在pH值5.0～10.0条件下反应20 min，测定产物丙酮酸的生成量，计算不同pH值下CBL的活性，结果如图5所示。

图5 pH值对CBL酶活的影响

由图5可知，重组酶在碱性条件下(pH值8.0～10.0)活性较高，在pH值8.0的条件下反应活性最高，在酸性溶液中(pH值<7.0)活性较低，在pH值5.0的条件下活性几乎为零。Alting等[10]从乳酸乳球菌中纯化的CBL在pH值5.0～5.5之间只有10%～15%的活性，在pH值7.5～8.5之间反应活性最高，在pH值>8.5时活性急剧下降。

取一定量CBL酶液分别在pH值5.0～10.0条件下于4 ℃保温10 h，测定产物丙酮酸的生成量，计算不同pH值下CBL的活性，结果如图6所示。

图6 CBL在不同pH值下的酶活稳定性

由图6可知，与保温前酶活力相比，重组酶在pH值6.0～9.0的条件下均能保持50%以上的活性，在pH值8.0的缓冲溶液中最稳定，保温10 h后仍能保留92%酶活力。但CBL在酸性条件下极易失活，在pH值5.0的缓冲溶液中保温10 h后酶完全失活。这可能是在酸性条件下CBL的结构不稳定所致。

2.3.3 动力学常数

测得重组CBL的KmL-cystathionine值为3.78 mmol·L-1，VmaxL-cystathionine值为0.928 mmol·L-1·h-1。文献中没有发现对其它物种来源的CBL动力学常数的测定。

3 结论

构建了能高效表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)，可溶性CBL的表达量达18 mg·L-1，占到菌体可溶性总蛋白的23%，破碎后上清液经一步亲和层析纯化得到CBL，回收率为71%，纯度达到94%，纯化后的CBL单位酶活为134.6 U·mg-1。在纯化的CBL溶液中加入5%甘油可以有效地防止冻融过程中CBL发生聚沉。重组酶的最适反应温度为35 ℃，酶活性稳定的温度范围为20～35 ℃。重组酶的最适反应pH值为8.0，4 ℃下在pH值8.0的缓冲溶液中保温10 h酶稳定性最高。重组CBL的KmL-cystathionine值为3.78 mmol·L-1，VmaxL-cystathionine值为0.928 mmol·L-1·h-1。建立了基于CBL催化反应产物丙酮酸与2,4-二硝基苯肼显色原理测定CBL酶活性的新方法。本研究结果为利用酶催化法测定Hcy的含量奠定了基础。

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