迷迭香酸对大鼠心肌缺血损伤保护作用机制的探讨

2011-07-25 10:27刘锡强田京伟
中成药 2011年7期
关键词:阳性细胞免疫组化心肌细胞

刘锡强, 李 丽, 田京伟

(1.淄博市中心医院干保科,山东淄博255036;2.烟台大学药学院,山东 烟台264000)

迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是1958年由Elis首次从唇形科植物迷迭香中分离得到,是水溶性多酚类化合物,在植物中的分布较为广泛,主要存在于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科的多种植物中[1-2]。国内外的研究证明,迷迭香酸是一种具有多功能的天然活性物质,具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节等广泛的药理学作用[3]。本实验通过建立大鼠冠脉结扎心肌缺血模型,观察迷迭香酸对心肌缺血保护作用的相关指标,从而探讨其可能机制,为中药开发治疗心血管疾病提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠120只,体质量(250±30)g,由山东绿叶制药天然药物研发中心提供。

1.2 药物与试剂 迷迭香酸实验样品由山东绿叶天然药物研发中心药理实验室提供,纯度为99.7%,硝酸异山梨酯(齐鲁制药有限公司,规格:10 mL:10 mg,批号:08110382);SOD试剂盒、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所生产,兔抗鼠多克隆抗体(bcl-2、bax):武汉博士德生物工程有限公司;UltraSensitiveTMS-P免疫组化染色试剂盒:福州迈新生物技术开发有限公司;HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统。

2 方法

2.1 动物分组与模型制备 取60只雄性Wister大鼠为A组,另取60只为B组,A、B各组随机分为假手术组(生理盐水10 mg/kg)、缺血模型组(生理盐水10 mg/kg)、硝酸异山梨酯组(20 mg/kg),迷迭香酸小剂量组(50 mg/kg),迷迭香酸中剂量组(100 mg/kg),迷迭香酸高剂量组(200 mg/kg)。各组给药体积均按20 mL/kg口服给予相应浓度药液,1次/d,连续灌胃5 d。大鼠连续灌胃给药5 d后,以100 mg/L水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后,仰位固定。自胸骨左侧3~4肋间纵行切开皮肤2 cm,分离筋膜及肌层,于心尖搏动明显处拨开肋间隙轻压右侧胸廓挤出心脏,在左心耳根部下方,即肺动脉圆锥及左房间找出冠状动脉左前降支,除假手术组只穿线不结扎外,其它各组在距起点2~3 mm处穿一“0”号丝线结扎,迅速将心脏复位,立即缝合胸壁使自主呼吸恢复,整个手术在30 s内完成。各组大鼠造模后2 h进行以下实验。

2.2 细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)量的测定 将A组大鼠心肌细胞沉淀加入冷的匀浆缓冲液,倒入玻璃匀浆管,插在冰水混合物中充分转动研磨。然后将心肌细胞匀浆液离心3000 r/min,4℃,15 min。取匀浆上清液,按试剂盒说明检测细胞内脂质过氧化物SOD活性和MDA量。

2.3 免疫组织化学方法观察心肌细胞bcl-2,bax蛋白表达取B组大鼠心尖部心肌,至10%福尔马林溶液中固定24 h,经80%的乙醇溶液递增充分脱水后,常规石蜡包埋,制成5 μm厚的石蜡切片,供光镜观察及细胞凋亡检测。按试剂盒说明书进行。胞浆内着棕黄色或褐色颗粒者为蛋白表达阳性细胞。在光学显微镜下观察心肌缺血周围区的bcl-2、bax的阳性细胞,采用病理图像分析系统对切片进行图像分析,测定每组切片bcl-2、bax免疫组化染色的平均光密度值和阳性细胞数。按照如下公式计算心肌细胞免疫组化阳性表达指数(PEI):PEI=平均光密度×阳性细胞百分率。

3 结果

3.1 迷迭香酸对心肌缺血大鼠心肌细胞SOD和MDA的影响 与假手术组比较,缺血模型组大鼠血清SOD活性降低(P<0.05)、MDA 量升高(P<0.05)。与缺血模型组比较,迷迭香酸大中小剂量组大鼠血清SOD活性增高、MDA量降低,并随着迷迭香酸剂量的增加,血清SOD呈升高趋势、MDA量呈降低趋势。ID组大鼠血清SOD活性也升高(P<0.05)、MDA量亦见降低(P<0.05)。结果表明迷迭香酸能剂量依赖性降低结扎冠状动脉诱发的心肌缺血大鼠细胞MDA量,增加SOD活性(见表1)。

表1 迷迭香酸对心肌缺血大鼠心肌细胞SOD、MDA及bcl-2,bax蛋白的影响(±s,n=10)

表1 迷迭香酸对心肌缺血大鼠心肌细胞SOD、MDA及bcl-2,bax蛋白的影响(±s,n=10)

注:与缺血模型组比较*P <0.05,**P <0.01;与假手术组比较△P <0.05 △△P <0.01。

组别 剂量/(mg/kg) SOD(u/mg) MDA/(nmol/mg蛋白) bcl-2/% bax/%假手术组 - 4.51 ±1.49 7.76 ±1.41 15.0 ±3.8** 3.90 ±0.8**心肌缺血组 - 1.93±0.68△ 12.88±1.79△ 20.4±3.9 30.5±6.1△△迷迭香酸小剂量组 50 2.56 ±0.57 11.36 ±1.94 23.1 ±3.9 22.3 ±3.8*迷迭香酸中剂量组 100 2.74±0.79* 11.05±1.34* 26.1±4.5△ 15.1±2.3*△迷迭香酸大剂量组 200 3.12±0.91* 10.59±1.82* 28.3±4.2△ 10.1±2.4**△ID 组 20 3.62 ±1.08** 10.11 ±2.84** 24.5 ±3.6 18.9 ±3.7*△

3.2 缺血心肌细胞bcl-2,bax蛋白表达的检测 免疫组化染色结果显示所有组别心肌细胞均有bcl-2,bax蛋白表达,假手术组bcl-2,bax蛋白表达量较少,染色呈浅棕色。与假手术组比,缺血模型组bax蛋白表达明显升高(P<0.01)。迷迭香酸各给药组bcl-2,bax蛋白的表达量比假手术组有所增加,但bax明显较缺血模型组低(P<0.05或 P<0.01)。与假手术组比较ID组bax蛋白表达升高(P<0.05),与缺血模型组比较ID组bcl-2蛋白表达无明显差异性,bax蛋白表达减少(P <0.05)(见表1)。

4 讨论

在心肌缺血时,儿茶酚胺在缺血区大量积蓄,经代谢可产生大量的氧自由基,在发生自氧化反应过程中产生大量的超氧阴离子和过氧化氢增加自由基水平。这些活性氧自由基可直接作用于心肌细胞膜而发生脂质过氧化反应,促进MDA生成增多及SOD活力降低。MDA是由自由基产生的脂质过氧化代谢产物,已普遍用作检测机体组织中自由基水平的指标;SOD是体内最重要的抗氧化酶,可反映机体抗氧化系统的功能。所以同时检测MDA量和SOD活性可了解自由基产生和抗氧化系统的功能状态[4]。迷迭香酸可使心肌细胞中MDA量降低、SOD活力显著增加(P<0.05或P<0.01),说明其对心肌缺血性损伤的保护作用可能与提高抗氧化酶活性,降低自由基水平,抑制脂质过氧化反应有关。

心肌缺血时,心肌组织不仅缺氧和代谢障碍,同时毒性产物蓄积,引起缺血性损伤,若继续发展导致心肌细胞死亡。近年来,普遍认为细胞死亡有两种机制,即坏死和凋亡。细胞凋亡是一种主动性的基因控制的细胞死亡形式,在正常的生长发育及许多疾病的发生中起着非常重要的作用。凋亡的启动与抑制受多种内源性及外源性信号的刺激[5],而且在其发生过程中,有许多因子的参与。其中促凋亡基因与抗凋亡基因bcl-2被认为与细胞凋亡关系密切。bax是bcl-2家族的一个成员,它具有独立于其它基因以外的细胞毒作用,可不依赖激活和抑制相关基因而诱导细胞凋亡。相反,bcl-2的抗凋亡作用一部分是通过抑制bax的细胞毒作用而实现的。本实验中Tunel染色进一步验证了心肌缺血损伤可导致凋亡细胞明显增多,免疫组化结果亦提示与对照组比较,缺血模型组bax阳性细胞表达明显增加,bcl-2亦有一定程度增加。目前抑制细胞凋亡的措施并不太多,有研究认为β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂及某些中药对细胞凋亡有抑制作用[6-7]。近年来,随着传统医学的发展,中药在心血管疾病中的作用越来越受到重视。本实验中迷迭香酸是山东省天然药物工程技术研究中心通过结构改造获得的一个单体化合物,经过结构改造后增加了其水溶性及稳定性。实验中与缺血模型组比较,迷迭香酸给药组细胞凋亡数目明显减少,免疫组化结果同时表明迷迭香酸能上调抗凋亡因子bcl-2和下调促凋亡因子bax的表达,说明迷迭香酸抗心肌缺血的机制可能与其对凋亡基因的调节密切相关。

[1]刘鹰翔,计志忠.迷迭香酸药理作用的研究进展[J].国外医药植物分册,1993,8(6):248-251.

[2]Chen Jianghong,Ho Chitang.Antioxidant activities of caffeic Acid and Its Related Hydroxycinnamic Acid Compounds[J].J Agric Food Chem,1997,45(7):2374-2378.

[3]陈立亚.迷迭香酸的研究概况[J].中国药事,2007,21(11):923-926.

[4]李 林,黄松明,赵三龙,等.氧化应激对大鼠肾脏系膜细胞增生的影响及迷迭香酸的干预作用[J].现代中西医结合杂志,2007,16(25):3627-3629.

[5]Thomnson CB.Apoptos is in the pathogenesis and treatment of diease[J].Seienee,1995,267:1456-1462.

[6]常志文,刘 琦.缺血再灌注心肌细胞凋亡及药物干预[J].中国新药杂志,2000(9):28-30.

[7]张 萍,林敬明,孝志粱,等.复方丹参注射渣对兔急性心肌梗塞细胞凋亡的影响[J].中药材,2001(24):502-504.

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