调营饮对化疗所致骨髓抑制小鼠造血细胞因子的影响※

郑仁省

(河北省冀州市医院中医科，河北 冀州 053200)

调营饮对化疗所致骨髓抑制小鼠造血细胞因子的影响※

郑仁省

(河北省冀州市医院中医科，河北 冀州 053200)

目的观察调营饮对化疗所致骨髓抑制小鼠造血细胞因子的影响。方法将168只清洁级昆明小鼠，随机分为正常组、模型组、调营饮组、调营饮拆方组、六味地黄汤组、八珍汤组、当归补血汤组，每组24只。正常组予0.9%氯化钠注射液0.2 mL腹腔注射，其余各组予注射用环磷酰胺(CTX)100 mg/kg腹腔注射，每日1次，连续3 d。实验第4 d，调营饮组、调营饮拆方组、六味地黄汤组、八珍汤组、当归补血汤组分别给予相应药液0.2 mL灌胃，正常组、模型组予等容积蒸馏水灌胃，每日1次，连续10 d。分别于实验第4、7、10 d取小鼠眼球血，测外周血白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)。同时，第7 d采用放射免疫分析法检测血液中促红细胞生成素(EPO)，之后取各组小鼠右侧股骨，采用免疫组化法观察粒－巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)平均光密度值。结果实验第4、7 d模型组及各药物组WBC均低于正常组(P＜0.05)。实验第10 d，模型组、调营饮拆方组、六味地黄汤组及当归补血汤组WBC均低于正常组(P＜0.05)。模型组各时间RBC均低于正常组(P＜0.05)。实验第4 d，调营饮组、调营饮拆方组及八珍汤组WBC较模型组升高(P＜0.05);调营饮拆方组、六味地黄汤组RBC与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。实验第7 d，调营饮组、八珍汤组WBC与模型组比较均明显升高(P＜0.05);调营饮组、调营饮拆方组RBC高于模型组(P＜0.05)。实验第10 d，各用药组WBC、RBC与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，且调营饮组WBC高于调营饮拆方组、六味地黄汤组和当归补血汤组 (P＜0.05)，调营饮组RBC高于其他各用药组(P＜0.05)。模型组EPO高于正常组(P＜0.05)，GM－CSF平均光密度值低于正常组(P＜0.05)。各用药组EPO、GM－CSF平均光密度值与模型组比较均有统计学意义(P＜0.05)，且调营饮组EPO、GM－CSF平均光密度值均高于其他各药物组(P＜0.05)。结论调营饮可明显提高化疗致骨髓抑制小鼠EPO分泌及GM－CSF的表达，从而改善外周血细胞状况，促进骨髓造血功能恢复。

骨髓疾病;疾病模型，动物;环磷酰胺;中药疗法;造血系统

骨髓抑制是化疗常见的副作用。目前，西医学常采用口服升白药物(如利血生、鲨肝醇、维生素B4等)，输注成分血或进行造血干细胞移植。但这些方法作用短暂且价格昂贵不易推广。为此，我们运用中医理论，根据骨髓抑制的临床表现，并结合临床实践，创制了具有滋肾填精、健脾益气兼活血养血功效的中药方调营饮。本研究通过对骨髓抑制小鼠予调营饮干预，以探讨调营饮对骨髓抑制小鼠造血细胞因子的影响，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级昆明小鼠168只，雌雄各半，体质量(20±2)g，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:803103。常规饲养，自由饮食。

1.1.2 实验试剂及仪器 注射用环磷酰胺(CTX)(山西普德药业有限公司，国药准字H14023686)200 mg加0.9%氯化钠注射液配制成浓度10 mg/mL溶液，第一抗体粒－巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)兔抗IgG多克隆抗体(博士德公司)，促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)放免试剂盒(北京普尔伟业生物科技有限公司)，第一抗体SP 9001试剂盒及DAB显色剂(北京中衫金桥生物技术有限公司)。

1.1.3 实验药物 调营饮:熟地黄25 g，山茱萸10 g，山药 30 g，黄芪 10 g，当归 10 g，鸡内金 10 g，黄精 10 g，何首乌10 g，丹参10 g，鸡血藤10 g。调营饮拆方:调营饮减丹参、鸡血藤。六味地黄汤:熟地黄24 g，山茱萸12 g，山药12 g，茯苓9 g，牡丹皮 9 g，泽泻 9 g。八珍汤:当归 10 g，川芎5 g，白芍药8 g，熟地黄 15 g，人参 3 g，白术 10 g，茯苓8 g，甘草5 g。当归补血汤:黄芪30 g，当归6 g。以上生药均同一批购自河北医科大学第四医院中药房。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 将实验动物随机分为7组，即正常组、模型组、调营饮组、调营饮拆方组、六味地黄汤组、八珍汤组、当归补血汤组，每组24只，雌雄各半。

1.2.2 动物模型制备 昆明小鼠常规饲养5 d后，参照王德俊等［1］方法进行模型制备。正常组予0.9%氯化钠注射液0.2 mL腹腔注射，其余各组予CTX 100 m g/kg腹腔注射，每日1次，连续3 d。

1.2.3 药物制备 分别将调营饮、调营饮拆方、六味地黄汤、八珍汤及当归补血汤按中药汤剂煎煮方法煎煮浓缩，配制成浓度分别为 4.50、3.83、2.50、2.13、1.20 g/mL 汤剂，置4℃冰箱保存备用。

1.2.4 给药方法 CTX腹腔注射4 h后，调营饮组、拆方组、六味地黄组、八珍汤组及当归补血汤组分别给予相应药液0.2 mL灌胃，正常组和模型组予等容积蒸馏水灌胃，每日1次，连续10 d。由于注射CTX后导致小鼠骨髓抑制，实验第5 d，模型组、六味地黄汤组各有1只小鼠死亡，6 d八珍汤组死亡2只，8 d当归补血汤组死亡1只，此5只小鼠不纳入统计。

1.2.5 标本采集 分别于实验后第4、7、10 d给药6 h后，各组随机取小鼠6～8只，摘眼球取血20 μL，用Sysmex－800自动血球计数仪自动检测外周血白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)。同时，第7 d采用放射免疫分析法检测血液中EPO，之后取各组小鼠右侧股骨，采用免疫组化法观察GM－CSF平均光密度值。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计学软件，计量资料用均数±标准差()表示，采用单因素方差分析法检验;组间比较采用SNK－q检验。

2 结果

2.1 各组不同时间RBC比较 见表1。

表1 各组不同时间RBC比较×1012/L，±s

表1 各组不同时间RBC比较×1012/L，±s

与正常组同期比较，*P ＜0.05;与模型组同期比较，△P ＜0.05;与调营饮组同期比较，#P ＜0.05

组 别 实验第4 d 实验第7 d 实验第10 d正常组10.99 ±1.09 10.78 ±1.07 10.63 ±1.08模型组 9.25 ±.84* 6.00 ±0.59* 7.05 ±0.60*调营饮组 9.36±0.96 7.88±.90△ 10.94±1.07△调营饮拆方组 10.56±0.82△ 7.54±0.79△ 9.61±0.82△#六味地黄汤组 10.55 ±0.76△ 6.86 ±0.91 7.98 ±0.62△#八珍汤组 9.28 ±.03 7.02 ±0.78 8.07 ±0.77△#当归补血汤组 9.31 ±0.86 6.35 ±0.62 8.77 ±0.75△#

由1可见，模型组各时间RBC均低于正常组(P＜0.05)。实验第4 d，调营饮拆方组、六味地黄汤组RBC与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。实验第7 d，调营饮组、调营饮拆方组RBC高于模型组 (P＜0.05)。实验第10 d，各用药组RBC均明显回升(P＜0.05)，且调营饮组高于其他各药物组(P＜0.05)。

2.2 各组EPO及GM－CSF平均光密度值比较 见表2。

表2 各组EPO及GM－CSF平均光密度值比较±s

表2 各组EPO及GM－CSF平均光密度值比较±s

与正常组比较，*P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05;与调营饮组比较，#P ＜0.05

组 别 n EPO(ng/mL) GM－CSF 平均光密度值正常组 8 0.53 ±0.13 0.14 ±0.02模型组 7 1.28 ±0.27* 0.08 ±0.01*调营饮组 8 1.92±0.25△ 0.21±0.02△调营饮拆方组 8 1.68 ±0.16△# 0.18 ±0.02△#六味地黄汤组 7 1.65 ±0.22△# 0.17 ±0.02△#八珍汤组 6 1.57 ±0.14△# 0.15 ±0.03△#当归补血汤组 8 1.54 ±0.20△# 0.13 ±0.03△#

由表2可见，模型组EPO高于正常组(P＜0.05)，GM－CS平均光密度值低于正常组(P＜0.05)。各用药组EPO、GM－CSF平均光密度值与模型组比较均有统计学意义(P＜0.05)，且调营饮组EPO、GM－CSF平均光密度值均高于其他各药物组(P＜0.05)。

2.3 各组不同时间WBC比较 见表3。

表3 各组不同时间WBC比较×109/L，±s

表3 各组不同时间WBC比较×109/L，±s

与正常组同期比较，*P ＜0.05;与模型组同期比较，△P ＜0.05;与调营饮组同期比较，#P ＜0.05

组 别 实验第4 d 实验第7 d 实验第10 d正常组8.53 ± 0.57 8.01 ± 0.67 8.70 ± 0.74模型组 3.13 ± 0.42* 3.51 ± 0.97* 3.99 ± 0.46*调营饮组 4.11 ± 0.59＊△ 5.09 ± 0.81＊△ 8.91 ± 0.96△调营饮拆方组 3.94 ± 0.60＊△ 4.10 ± 0.59* 6.10 ± 0.52＊△#六味地黄汤组 3.81 ± 0.43* 4.06 ± 0.49* 6.35 ± 0.39＊△#八珍汤组 4.26 ± 0.82＊△ 4.63 ± 0.56＊△ 8.21 ± 0.46△当归补血汤组 3.84 ± 0.63* 4.15 ± 0.62* 5.90 ± 0.60＊△#

由表3可见，实验第4、7 d模型组及各药物组WBC均低于正常组(P＜0.05)。实验第10 d，模型组、调营饮拆方组、六味地黄汤组及当归补血汤组WBC均低于正常组(P＜0.05)，而调营饮组及八珍汤组与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。实验第4 d，调营饮组、调营饮拆方组及八珍汤组WBC较模型组升高(P＜0.05)。实验第7 d，调营饮组、八珍汤组WBC与模型组比较均明显升高(P＜0.05)。实验第10 d，各用药组WBC与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);调营饮拆方组、六味地黄汤组、当归补血汤组WBC均低于调营饮组(P＜0.05)，而八珍汤组与调营饮组比较差异无统计学意义 (P＞0.05)。

3 讨论

CTX为是临床常用的抗肿瘤药物，对多种肿瘤细胞具有抑制作用。其作用机制为细胞周期非特异性药物。在体外无抗癌效果，需在体内经肝微粒体混合功能氧化酶活化后，产生具有烷化活性的磷酰胺氮芥，发挥其细胞毒作用［2］。骨髓抑制为其主要的不良反应之一，表现为WBC、RBC减少，严重时全血细胞减少。故本实验采用CTX腹腔注射，复制骨髓抑制模型，操作方法简单，重复性好。WBC、RBC能直接反映机体血液细胞的情况，间接反映骨髓造血功能及药物对骨髓造血功能的影响，可作为评价药物对造血功能影响的重要指标。

骨髓红系细胞的正常分裂、分化和成熟受多种细胞因子的调控，其中EPO发挥关键性作用。EPO主要是由肾脏近曲小管细胞和肾皮质、外层髓质的小管周围毛细内皮细胞分泌的一种具有生物学效能的糖蛋白，与集落刺激因子(CSF)和白细胞介素(IL)相比，EPO作用的细胞谱系最具特异性。EPO能特异性刺激红系造血细胞的生长、分化和增殖［3］，从而促进WBC生成。本实验小鼠经CTX腹腔注射后，外周血RBC明显低于正常组，而EPO却高于正常组，推测可能是CTX腹腔注射导致小鼠贫血，反射性的促进了EPO的合成所致。GM－CSF是由激活的T淋巴细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等产生的一种糖蛋白，对早期造血祖细胞具有广泛增殖、促进活性作用。同时，GMCSF有种属特异性，主要作用于髓系祖细胞，通过与其高亲和力受体结合发挥生物学效应，使其迅速进入细胞周期向粒系及巨噬系分化，最后成为成熟细胞，并能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能［4］。重组人GM－CSF已广泛运用于临床，常用于治疗癌症化疗所致的骨髓抑制、再生障碍性贫血及白细胞减少症等［5］。

中医学认为，化疗所致的骨髓抑制属中医学血虚、虚劳范畴，病机为肾虚精亏，脾虚兼血瘀。治宜滋肾填精，健脾益气，养血活血［6］。调营饮重用熟地黄补肾养血，益精填髓，培补先天，为君药;山药、黄芪、当归健脾益气补血以培后天，山茱萸、黄精、何首乌补益肝肾精血，以合乙癸同源，精血互生之理，达先后天同治，脾肾共补，气血共调之目的，为臣药;鸡内金健脾消食，以助运化，丹参、鸡血藤养血活血，祛瘀生新，以助气血化生，为佐药。诸药配伍，有滋肾填精健脾益气，兼活血养血功效。实验研究证明，调营饮可改善化疗所致骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核细胞，促进骨髓造血功能恢复及增强免疫功能［6－7］。

本实验结果表明，调营饮可明显提高化疗致骨髓抑制小鼠EPO分泌及GM－CSF的表达，从而改善外周血细胞状况，促进骨髓造血功能恢复。

(指导老师:刘亚娴)

［1］王德俊，盛树青，李瑞琴，等.螺旋藻多糖对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的实验研究［J］.中国临床药理学与治疗学，2001，6(1):46－48.

［2］周际昌.实用肿瘤内科学［M］.2版.北京:人民卫生出版社，1999:234－235.

［3］中华内科杂志编委会.全国造血生长因子与细胞因子在血液病的应用研讨会纪要［J］.中华内科杂志，1994，33(5):336－338.

［4］尉达民，王良绪，陈萍生，等.rhIL－6，rhGM－CSF和rhEPO对人造血干细胞的作用［J］.中华内科杂志，1994，33(5):298－301.

［5］陈陵，邹霓，段美华.造血生长因子的临床应用［J］.中国实用儿科杂志，1996，11(4):241－242.

［6］郑仁省.调营饮对化疗所致骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核细胞的影响［J］.河北中医，2011，33(1):104－108.

［7］郑仁省，刘亚娴.调营饮对化疗所致骨髓抑制小鼠造血调控的影响［J］.中医药通报，2010，9(6):57－60.

Investigation of Tiaoyangyin on hematopoietic cytokines in mice of chemotherapy－induced bone marrow suppression

ZHENG Rensheng.Department of Traditional Chinese Medicine，Hebei Jizhou Hospital，Hebei，Jizhou053200

ObjectiveTo investigate the effect of Tiaoyangyin on hematopoietic cytokines in mice of chemotherapy－ induced bone marrow suppression.Methods168 mice were randomly seven groups，control group，model group，Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group，Decoction of Eight Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group.There were 24 mice in each group.Control group

intraperitoneal injection of 0.9%sodium chloride injection 0.2 mL，the rest of the group received intraperitoneal injection of cyclophosphamide(CTX)100 mg/kg，once a day，continuous 3 days.Experiment No.4 d，Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group，Decoction of Eight Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group were given 0.2 mL of corresponding liquid fed，the normal group and model group were given equal volume of distilled water，once a day，continuous 10 d.White blood cell count(WBC)and red blood cell count(RBC)in peripheral blood from eye of mice blood at experiment No.4，7 and 10 d.while blood erythropoietin(EPO)were detected by radioimmunoassay at the first 7 d.Mean optical density value of GM－CSF from the right femur of mice were observed using immunohistochemical staining.ResultsWBC in model group and each treatment group was lower than that in control group at experiment No.4 and 7 d(P＜0.05).WBC in model group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group was lower than that in control group at experiment No.10 d(P＜0.05).There was no significant difference between Tiaoyangyin group，Decoction of Eight Ingredients group and control group on WBC(P＞0.05).RBC in model group was lower than that in control group at difference time(P＜0.05).WBC in Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group and Decoction of Eight Ingredients group was higher than that in control group at experiment No.4 d(P＜0.05).There was significant difference between Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group and model group on RBC(P＜0.05).WBC in Tiaoyangyin group and Decoction of Eight Ingredients group was significantly increased in comparison with that in model group at experiment No.7 d(P＜ 0.05).There were significant differences between each treatment group and model group on WBC and RBC at experiment No.10 d(P＜0.05).There were significant differences between each treatment group and model group on EPO and mean optical density value of GM－CSF(P＜0.05).ConclusionTiaoyangyin can significantly increase GM－CSF secretion of EPO expression in mice of chemotherapy－induced bone marrow suppression，thereby improving the status of peripheral blood cells and promote functional recovery of bone marrow.

Bone marrow disease;Disease model;Animal;Cyclophosphamide;Therapy of traditional Chinese medicine;hemopoietic system

R－332;R730.55;R322.2;R283.661

A

1002－2619(2011)07－1055－04

※项目来源:河北省中医药管理局2008年度中医药、中西医结合科研计划项目(编号:2008034)

郑仁省(1974—)，女，主治医师，硕士。从事中西医结合肿瘤临床与研究。

2011－04－15)