AngⅡ对人脐静脉内皮细胞BMP-2表达的影响

邬梅芳 彭道泉 丁家崇

(1.湖南省老年医院心内科; 2.湘雅二医院心内科 长沙 410016)

近期研究表明动脉粥样硬化的钙化具有骨钙化的特征[1],骨形态发生蛋白-2(BMP-2)作为转化生长因子β细胞因子超家族成员中的一员,在骨形成和骨愈合过程中是不可缺少的细胞因子。在人动脉粥样硬化的钙化斑块中发现有BMP-2的mRNA的表达,所以进一步推测BMP-2与人动脉粥样硬化的发生和发展密切相关[2～3]。

RAS系统及其主要活性物质血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在动脉粥样硬化发生发展中居于核心地位,起着关键性作用。但其与BMP-2的关系的研究却鲜有报道,本研究通过体外细胞培养用AngⅡ刺激细胞同时用其拮抗剂厄贝沙坦干预来研究BMP-2表达的影响,并用免疫组织化学法来测定NFkb-P65的表达,初步探讨其可能机制。

表1 不同浓度AngⅡ及厄贝沙坦干预后对HUVECs上清液中BMP-2浓度的影响(±s)

表1 不同浓度AngⅡ及厄贝沙坦干预后对HUVECs上清液中BMP-2浓度的影响(±s)

注:与对照组(0μmol/L AngⅡ)相比,*P<0.01;与厄贝沙坦干预组比较,△P<0.01

组别(n=4) BM P-2(pg/m L)0µm ol/L A ngⅡ 14.76±1.44 5µm ol/L A ngⅡ (31.49±2.31)＊10µm ol/L A ngⅡ (38.41±2.81)＊20µm ol/L A ngⅡ (78.51±2.16)＊,△20µm ol/L A ngⅡ+5µm ol/L 厄贝沙坦 22.62±2.47

1 对象与方法

1.1 实验对象

人脐静脉内皮细胞株。

1.2 实验方法

HUVECs的体外培养(方法略),选择3～4代HUVECs进行转板长满后随机分为5组给予不同浓度的AngⅡ、厄贝沙坦,干预48h后观察对BMP-2的表达的影响,具体如下:药物终浓度分别为:AngⅡ0.5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,AngⅡ20μmol/L+5μmol厄贝沙坦,干预48h用ELISIA法检测细胞上清液中BMP-2的水平,并且用免疫组织化学测定NFkb-P65亚基的核转移。

1.3 图象分析

采用病理图文分析系统对切片进行分析。

表2 不同浓度的AngⅡ对HUVECs的NF-kB表达的病理图像分析结果(±s)

表2 不同浓度的AngⅡ对HUVECs的NF-kB表达的病理图像分析结果(±s)

注:与对照组(0μmol/L AngⅡ)相比,*P<0.01;与厄贝沙坦干预组比较,△P<0.01

组别(n=4)N F平均吸光度 阳性面积百分比0µm ol/L 0.244±0.02 0.137±0.02 5µm ol/L (0.349±0.03)＊ (0.358±0.02)＊10µm ol/L (0.644±0.02)＊ (0.740±0.04)＊20µm ol/L (0.919±0.03)＊,△ (0.926±0.05)＊,△20um ol/L+5µm ol/L 厄贝沙坦 0.561±0.02 0.730±0.03

1.4 统计学处理

采用SPSS 14.0统计软件分析。所有资料均采用均数±标准差(±s)表示,进行正态分布性检验,P＜0.05为有显著性差异,P＜0.01为有非常显著性差异。

2 结果

2.1 不同浓度的AngⅡ对HUVECs的BMP-2表达的影响

随着AngⅡ浓度的升高,细胞培养基上清液中的BMP-2浓度明显增高(P＜0.01),且有一定的浓度的依赖性,线性相关分析是正相关关系,r=0.98(P＜0.05);而给予厄贝沙坦联合刺激细胞培养基上清液中的BMP-2浓度明显降低(P＜0.01),具体见表1。

2.2 细胞免疫组织化学检测HUVECs的NF-kB的表达量

细胞免疫组化结果,NF-kB在未被激活时在胞浆有所表达,受到刺激激活后可见到胞核表达。本研究发现:HUVECs在一定AngⅡ浓度刺激下,可以见到NF-KbP65的激活,表达增加。而在厄贝沙坦干预后,NF-KbP65表达的阳性减弱。病理图文分析结果如表2:AngⅡ刺激后平均吸光度和阳性面积百分比均增加,厄贝沙坦干预后明显下降,有统计学差异(P＜0.01)。

3 讨论

动脉钙化是动脉粥样硬化的病理改变之一,而BMP-2作为β细胞因子超家族中的一员,与动脉钙化关系最为密切,其在血管表达可能与氧化应激,炎症及高血糖等代谢紊乱有关[4～5]。

AngⅡ在动脉粥样硬化发生发展中起着关键性的作用,而这些作用可被其受体拮抗剂(ARB)药物阻断,血管钙化一般发生于有动脉粥样硬化的病变处,被作为动脉粥样硬化的标志,应用于预测动脉粥样硬化程度,但二者的发生又有不同的机制。尽管AngⅡ在AS中的研究深入透彻,但与血管钙化的关系如何,相关研究甚少。Csiszar A[6]发现:TNF-α可诱导NF-кB激活并引起BMP-2mRNA及BMP-2蛋白表达显著增加,认为炎性刺激以及血管内高压力可引起H2O2介导的NF-kB激活,从而调节血管BMP-2表达。而AngⅡ被认为是致动脉硬化因子,推测其可能对BMP-2有调节作用,对此,我们做了初步的探讨。

血管内皮细胞是动脉粥样硬化病理改变的基本单元,所以本实验选择内皮细胞作为研究对象,并发现:一定浓度的AngⅡ可以增加细胞培养液中BMP-2的浓度,说明AngⅡ的刺激可以增加BMP-2的表达。本研究细胞免疫组化结果显示:在AngⅡ诱导BMP-2表达增加的同时,一定浓度的AngⅡ刺激,可使NFkb-P65在细胞核内表达明显增加,提示BMP-2表达与NF-kB的激活有关,AngⅡ刺激内皮细胞BMP-2表达的机制可能是通过NF-kB途径来实现的。

本研究同时用ARB药厄贝沙坦干预,发现厄贝沙坦可以下调BMP-2的表达,相应抑制NFKb-P65在胞核的表达,提示厄贝沙坦有可能是通过对抗氧化应激损伤,抑制NF-Kb通路的激活,而最终实现下调BMP-2的表达,提示厄贝沙坦具有潜在的阻止血管钙化进展的可能,这也许提示厄贝沙坦不仅可以治疗高血压,抗动脉粥样硬化作用,而且可能具有预防血管钙化的作用。

4 结语

AngⅡ可以增加脐静脉内皮细胞BMP-2表达,并呈浓度依赖性,可能与损伤脐静脉内皮细胞,使氧化应激水平增加,而激活NFkb-p65有关。

厄贝沙坦干预能阻断AngⅡ诱导的的脐静脉内皮细胞BMP-2的表达,其机制可能是通过抑制NFkb通路来实现。

[1]Demer L,Watson KE,Bostrom K.Mechanism of calcification in atherosclerosis[J].Circulation,2005,111(18):2364～2372.

[2] Deneke Y,Langner K,Grewe PH,et al.Ossification in atheroscle

rotic arteries[J].Z Kardiol,2001,90(suppl 3):III-106～III-115.[3] Bostrom K.Proinflammatory vascular calcification[J].Circ Res,

2005,96 (12 ):1219～1220.

[4]Hruska KA,Mathew S,Saab G.Bone morphogenetic proteins in vascular calcification[J].Circ Res,2005,97(2):105～114.

[5] Parhami F,Bostrom K,Watson K,et al.Role of molecular regulation in vascular calcification[J].J Atheroscler Thromb,1996,3(2):90～94.

[6] Csiszar A,Smith KE,Koller A,et al.Kaley G,Edwards JG,Ungvari Z.Regulation of bone morphogenetic protein-2 expression in endothelial cells[J].Circulation,2005,111(18):2364～2372.