三黄泻心汤对LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎性细胞因子影响的研究＊

周晓玲 张海 孟宪丽 胡泊洋

（成都中医药大学药学院药理教研室，四川 成都610075）

三黄泻心汤为医圣张仲景名方，记载于《金匮要略》，由大黄、黄连和黄芩三味药组成，全方重在泻火解毒，清热燥湿，后世广泛用于里热火毒之证，为历验不爽之名方［1］。在前期工作中，发现大黄－黄芩药对在实验中显示出最强的抗内毒素活性，其作用甚至超过了全方，在此基础上筛选出了泻心汤有效组分，由黄芩总黄酮与大黄总游离蒽醌配比而成。黄芩总黄酮与大黄总游离蒽醌各配比有一定程度的抑制巨噬细胞分泌NO的作用，并且泻心汤有效组分能明显抑制内毒素诱导的巨噬细胞炎症物质IL－1β、TNF－α、iNOS mRNA的表达［2］。但是，前期的实验主要是动物实验，本实验从另一个角度，采用细胞培养的方法，建立LPS刺激RAW264.7细胞的炎症细胞模型，观察三黄泻心汤对RAW264.7细胞释放炎性细胞因子的影响，从而为三黄泻心汤是否对LPS攻击产生的脓毒症具有保护作用以及能否用于临床脓毒症的治疗提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物

大黄游离蒽醌提取物，江苏省淮安市瑞雷生化制品有限公司；黄芩总黄酮提取物，四川世坤植化有限公司；有效组分为大黄游离蒽醌与黄芩总黄酮按重量比3∶2配伍而成［3］。黄连、黄芩、大黄三味药均为饮片，购自北京同仁堂成都春熙路北口店，泻心汤由大黄、黄连、黄芩按2∶1∶1的剂量比组成。

1.1.2 试剂

ELISA试剂盒，R＆D进口分装；LPS Sigma公司；噻唑蓝（MTT），购自Salarbio公司；二甲基亚砜（DMSO），成都市科龙化工试剂厂生产；细胞培养液，赛墨飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；胎牛血清，北京元亨金马生物技术开发公司。

1.1.3 细胞

RAW264.7细胞株购于上海中科院生物科学研究院。

1.1.4 仪器

细胞CO2孵箱（日本SANYO公司，型号：MCO－15AC）；倒置显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：IX70）；超净工作台（苏州净化公司，型号：SW－CJ－2F双人双面净化工作台）；细胞培养板（美国COSTAR公司）；酶标仪（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7细胞培养

RAW264.7细胞用含10%胎牛血清（FBS）、100U·ml－1青霉素，100U·ml－1链霉素的DMEM培养液培养，细胞贴壁生长，长满瓶底80%时，弃去培养液，加入含胰酶消化液1－2ml，消化约2－5min，弃消化液，加入新培养液吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶，加入6.3ml DMEM＋0.7ml FBS，置37℃、5%CO2孵箱培养，隔天换液一次。传代三次以上，细胞进入对数生长期，即可用于实验。

1.2.2 MTT法检测不同浓度三黄泻心汤对RAW264.7生长活性的影响

取对数生长期细胞，将浓度为2×105·ml－1的细胞加入96孔板，每孔200μl，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。待细胞融合后，弃上清液。每孔加入100μl DMEM，再加100μl不同浓度的药物干预培养或无血清DMEM。设置空白对照组、受试药物组。空白对照组培养液中加入等体积无血清DMEM，受试药物组加入不同浓度的各受试药物。每组均设6个复孔。在37℃、5%CO2中培养24h。细胞于培养结束，加入5mg·ml－1MTT 20μl，继续培养4h。吸出培养液，并加入150μl DMSO，490nm测定各组的OD值。

1.2.3 三黄泻心汤对RAW264.7释放炎性细胞因子的影响

将浓度为2×105·ml－1的细胞加入24孔板，每孔l ml，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱平衡贴壁24h。待细胞融合后，弃去上清液。重新加入DMEM培养液800μl。每孔加入不同浓度的三黄泻心汤、三黄泻心汤有效组分或无血清DMEM 100μl，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1h后，加入无血清DMEM培养液100μl。24h后，取细胞上清液200μl，－20℃冻存。

实验分组及所加试剂：空白组：DMEM＋DMEM；A1组：泻心汤250μg·ml－1；A2组：泻心汤50μg·ml－1；A3组：泻心汤10μg·ml－1；B1组：有效组分50μg·ml－1；B2组：有效组分10μg·ml－1；B3组：有效组分2μg·ml－1。

1.2.4 三黄泻心汤对LPS刺激的RAW264.7释放炎性细胞因子的影响

将浓度为2×105·ml－1的细胞加入24孔板，每孔l ml，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱平衡贴壁24h。待细胞融合后，弃去上清液。重新加入DMEM培养液800μl。每孔加入1μmol·L－1烟碱、不同浓度的三黄泻心汤和三黄泻心汤有效组分或无血清DMEM 100μl，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1h后，分别加入1μg·ml－1LPS或无血清DMEM培养液100μl。24h后，取细胞上清液200μl，－20℃冻存。

实验分组及每组所加试剂如下：空白组：DMEM＋DMEM；模型组：DMEM＋LPS；A1组：泻心汤250μg·ml－1＋ LPS；A2组：泻心汤50μg·ml－1＋LPS；A3组：泻心汤10μg·ml－1＋LPS；B1组：有效组分50μg·ml－1＋LPS；B2组：有效组分10μg·ml－1＋ LPS；B3组：有效组分2μg·ml－1＋ LPS。

2 结果

2.1 不同浓度三黄泻心汤对RAW264.7生长活性的影响

采用MTT法检测不同浓度三黄泻心汤对RAW264.7生长活性的影响，实验结果显示：1μg·ml－1的LPS，50μg·ml－1、10μg·ml－1、2μg·ml－1的三黄泻心汤有效组分和250μg·ml－1、50μg·ml－1、10μg·ml－1的三黄泻心汤对RAW264.7细胞的生长活性均无影响，见表1、2。

2.2 三黄泻心汤对RAW264.7释放炎性细胞因子的影响

为了排除三黄泻心汤对正常RAW264.7细胞释放细胞因子可能的直接作用，我们检测了不同浓度的三黄泻心汤对RAW264.7细胞释放细胞因子的影响。结果表明：未加三黄泻心汤时细胞上清中 TNF－α浓度为16.076±0.042pg·ml－1，50、10、2μg· ml－1的三黄泻心汤有效组分和250、50、10μg·ml－1的三黄泻心汤对RAW264.7细胞释放炎性细胞因子均无影响，见表3。

表1 泻心汤对raw264.7细胞生长活性的影响（±s，n＝6）

表1 泻心汤对raw264.7细胞生长活性的影响（±s，n＝6）

组别 浓度（μg·ml－1） OD值空白组2.033±0.108泻心汤 A1 250 2.108±0.171泻心汤 A2 50 2.044±0.123泻心汤－A3 10 1.929±0.124

表2 泻心汤有效组分对raw264.7细胞生长活性的影响（±s，n＝6）

表2 泻心汤有效组分对raw264.7细胞生长活性的影响（±s，n＝6）

组别 浓度（μg·ml－1） OD值空白组B3 2 1.504±0.182 1.504±0.182泻心汤有效组分B1 50 1.554±0.166泻心汤有效组分B2 10 1.651±0.203泻心汤有效组分－

2.3 三黄泻心汤对LPS刺激的RAW264.7释放炎性细胞因子的影响

模型组与空白组比较，模型组TNF－α含量显著增加，达到753.021pg· ml－1（P＜0.01）。 同 模 型 组 比 较，50、10、2μg·ml－1的有效组分组TNF－α受到不同程度的抑制，但是250、50、10μg·ml－1的泻心汤组 TNF－α浓度与模型组无显著性差异，见表3。

3 讨论

内毒素血症（Intestinal end toxemia，IETM）是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输人大量内毒素污染的液体而引起，分为内源性和外源性两种，其进一步发展可能引起全身炎症反应综合征（SIRS）或多功能器官衰竭（MODS）的发生而导致死亡［4］。其作用机制是LPS进入机体后，大部分与血浆LPS结合蛋白（LPS binding protein，LBP）结合，形成复合体转运给单核巨噬细胞膜表面的受体CDl4分子，LPS的信号传递需借助膜上的另一个受体TLR4（Toll like receptor 4）发挥内毒素的生物学作用，TLR4在辅助受体CD12的帮助下，经过一系列生化反应，最后激活核因子AP－1和NF－κB。AP－1和NF－κB可介导机体产生多种生物活性分子，如肿瘤坏死因子（TNF－a）、HMGB1、白细胞介素（IL）等肽类物质，白三烯等脂类介质及一氧化氮等，导致肝脏和其他脏器受损［5］。

表3 三黄泻心汤对LPS刺激和未刺激的RAW264.7释放炎性细胞因子的影响（±s，n＝6）

表3 三黄泻心汤对LPS刺激和未刺激的RAW264.7释放炎性细胞因子的影响（±s，n＝6）

注：与模型组比较，＊＊p＜0.01。

TNF－α（pg·ml－1）刺激空白组别 浓度（μg·ml－1）LPS未刺激 LPS 16.076±0.042 22.326±0.992模型 － － 753.021±106.768泻心汤 A1 250 23.388±2.467 694.732±49.347泻心汤 A2 50 24.928±2.359 711.843±94.785泻心汤 A3 10 21.384±5.927 710.151±47.403泻心汤有效组分B1 50 23.053±6.519 704.299±43.433泻心汤有效组分B2 10 18.120±0.749 536.479±47.664＊＊泻心汤有效组分B3 2 19.886±5.079 535.394±74.399－＊＊

肿瘤坏死因子在内毒素血症产生的各种细胞因子中，起着关键性作用。有人认为在内毒素刺激下，TNF－α首先产生、释放增加，激发细胞因子网络，造成细胞因子级联反应，诱发其他炎症介质，从不同环节参与体内炎症反应，引起多器官组织损伤［6］。因此，在本实验研究中，我们首先选取TNF－α为监测指标。而三黄泻心汤对LPS刺激的其他炎症因子和抗炎因子的作用在以后的实验过程中将进一步研究。

本研究参照其他实验室的经验，根据具体实验最终选择LPS 1μg·ml－1刺激细胞建立炎症细胞模型。为了排除三黄泻心汤对RAW264.7细胞因子释放的抑制作用是其细胞毒作用所致，我们观察了不同浓度三黄泻心汤对RAW264.7细胞活力的影响。实验结果显示三黄泻心汤有效组分可抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF－α，各个浓度的三黄泻心汤对细胞活力无明显影响，显示其影响细胞因子释放作用与细胞毒作用无关，为三黄泻心汤能否用于临床脓毒症的治疗提供了一定的理论依据。

实验结果显示50μg·ml－1比10μg·ml－1、2μg·ml－1的三黄泻心汤有效组分对LPS刺激的RAW264.7释放TNF－α的抑制作用弱，这可能与药物作用机制有关。实验中观察到50μg·ml－1、10μg·ml－1、2μg·ml－1的有效组分组 TNF－α受到不同程度的抑制，但是250μg·ml－1、50μg·ml－1、10μg·ml－1的泻心汤组TNF－α浓度与模型组无显著性差异。这可能与泻心汤在给药前的处理过程有关，我们将进一步对处理前与处理后三黄泻心汤的化学成分与含量进行检测，探索其原因。

1 张保伟，刘渡舟.《金匮要略》泻心汤诸问浅识［J］.中医函授通讯，2000，19（5）：15－16.

2 孟宪丽，熊玉霞，杨娜，等.泻心汤有效组分配伍对脂多糖诱导的大鼠腹腔巨噬细胞活化的影响［J］.中药药理与临床，2007，23（5）：27－30.

3 熊玉霞，孟宪丽，杨娜，等.泻心汤有效组分及其配伍配比对大鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮的影响［J］.中药材，2007，1（30）：66－69.

4 Wichmann WM，Inthorn D，Andress HJ，et al.Incidence and mortality of sever sepsis in surgical intensive care patients：the influence of patient gender on disease process and outcome［J］.Intensive Care Med，2000，26（2）：167－172.

5 Shimazu R，Akashi S，Ogata H，et al.MD－2，a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll－like receptor 4［J］.J Exp Med，1999，189（11）：1777－1782.

6 Cavaillon JM，Adib－Conquy M，Fitting C，et al.Cytokine cascade in sepsis［J］.Scand J Infect Dis，2003，35（9）：535－544.