IκBα、IKKα、IKKβ与Tim-3在肿瘤患者中表达及相关性研究

杨子彬 李善华 张龙飞 冯俊霞 李合华

核因子（NF）-κB是重要的转录调控因子，其广泛存在于各种细胞中，参与免疫应激、细胞增殖、生长分化及细胞凋亡。NF-κB通常与其抑制蛋白IκB相结合，以非活性状态储存于细胞质中，只有当激活IκB激酶（IKK），水解IκB，解除了IκB的抑制作用，NF-κB才能进入细胞核中并与相应靶基因上的DNA序列（κB位点）结合，发挥基因转录功能。T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子-3（Tim-3）蛋白特异性表达于Th1细胞表面并参与自身免疫疾病的发病，也参与肿瘤免疫[1]。为进一步探讨IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3在肿瘤患者体内之间的关系，本研究检测了IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3 mRNA水平，并分析这些指标之间的相关性，报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2010年8月—9月在我院肿瘤内科接受化疗的中晚期肿瘤患者32例（肿瘤组），男17例，女15例，平均（57.7±12.6）岁。其中肺癌16例，胃癌4例，乳腺癌2例，结肠癌3例，直肠癌、食管癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、血管母细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤各1例。选择同期在我院进行体检的健康人群34例（对照组），其中男19例，女15例，平均（44.0±11.0）岁。2组性别构成差异无统计学意义（χ2=0.510，P>0.05），肿瘤组年龄大于对照组，差别有统计学意义（t=4.147，P<0.01）。

1.2 仪器和试剂 实时定量PCR仪（ABI 7300）、台式高速离心机（Sigma），TRIzol总RNA提取试剂、Quant cDNA第一链合成试剂盒及Real Master Mix（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司）、人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司）。

1.3 引物设计 根据文献[2]设计IκBα、IKKα和IKKβ的引物 。IκBα：上游 5′-GCAAAATCCTGACCTGGTGT-3′ ，下游5′-GCTCGTCCTCTGTGAACTCC-3′；IKKα：上游5′-AAACCA GAAAATTGTTGTGGACTTAA-3′，下游5′-ATCGAATCCCAG ACCCTATATCAC-3′；IKKβ：上游5-CCGACAGAGTTAGCAC GACA-3′，下游5′-GGCAATCTGCTCACCTGTTT-3′。Tim-3引物由天津润泰科技发展有限公司设计，上游5′-TCTTTGGCCA ACCTCCCTCCCT-3′，下游5′-TGTGAGGGTTGCTGCC5TGC T-3′；内参照GAPDH引物：上游5′-AGCCGCATCTTCTTTT⁃GCGTCG-3′，下游5′-TGACCAGGCGCCCAATACGA-3′。

1.4 外周血淋巴细胞分离 采集空腹肘正中静脉血2 mL，EDTA抗凝，利用人淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。PBS洗涤2遍备用。

1.5 RNA提取并反转录为cDNA 于淋巴细胞中加入1 mL TRIzo（l北京天根生化科技有限公司），破解细胞，加入氯仿，抽提水相中的总RNA；使用Quant cDNA第一链试剂盒按照说明书操作进行反转录：取上述总RNA 4 mL（约2 mg），Oli⁃go-dT15（10 mmol/L）2 mL，10×RT mix 2 mL，dNTP 混合液（2.5 mmol/L）2 mL，Quant Reverse Transcriptase 1 mL，无酶水9 mL，总计20 mL；彻底混匀，37 ℃ 1 h。

1.6 实时定量PCR 20 mL PCR反应体系：上述cDNA 1 mL，上下游引物各1 mL，2.5×Real Master Mix/20×SYBR solution 9 mL，无酶水8 mL；实时定量PCR反应条件：94℃1 min预变性，94℃ 20 s变性，58℃ 15 s复性，68℃ 30 s延伸，重复40个循环。△Ct=Ct目的基因-CtGAPDH后，计算出标准化的2-△Ct值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计处理，正态分布资料采用±s表示，行t检验，非正态分布采用中位数和四分位间距M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验（Wilcox⁃on法），相关分析采用Spearman等级相关，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表达水平比较 肿瘤组IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1。

表 1 2组IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表达水平比较M（P25，P75）

2.2 肿瘤患者IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3之间的相关性分析 IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3之间均呈正相关（P<0.01），见表2。

表2 肿瘤患者4项指标之间的相关系数 （rs）

3 讨论

IκBs作为NF-κB的的抑制蛋白，能和NF-κB的核定位信号域结合，从而抑制NF-κB的活性。IκBα是IκBs的最主要成员之一，是NF-κB的主要调控蛋白[3]。IKK是IκB的激酶，主要由IKKα、IKKβ和IKKγ组成。其中IKKα、IKKβ具有激活IκB的功能，而IKKγ不含催化激酶结构，没有激活IκBα的功能。IKKβ/NF-κB途径称为经典途径，而IKKα/NF-κB途径称为旁路途径。IKKα和IKKβ对IκB激活作用是以IKKβ为主要成分[3]。多数恶性肿瘤发病与IKK途径被激活有关。本研究结果显示肿瘤患者的IκBα、IKKα、IKKβ mRNA表达均低于对照组，并且IκBα与IKKα、IKKβ相关系数分别是0.418和0.729，说明IκBα主要是由IKKβ激活。IKKα也参与了IκB激活，形成肿瘤，与文献[4]有相同的认识。

Tim基因家族有调节Th1和Th2细胞介导的免疫应答作用。Tim-3蛋白特异性表达于Th1细胞表面，可以作为区分Th1和Th2细胞的标志，有抑制Th1细胞免疫功能的作用并参与肿瘤免疫[1]。Tim基因家族蛋白是炎症关键调控因子。在Th1细胞介导的免疫应答中，Tim-3分子通过和Tim-3配体（Galectin-9，Tim-3L）相互作用而发挥作用。Tim-3在肿瘤免疫中通过Galectin-9促进树突状细胞（DC）的成熟来增强免疫应答[5]，通过活化巨噬细胞等途径间接激活T细胞[6]。但也有人认为可溶性Tim-3能显著降低T细胞的抗肿瘤免疫，具有负性调节作用[7]。Tim-3表达量的升高会抑制机体的抗肿瘤能力，促进黑色素瘤的发展[8]。本研究结果显示肿瘤患者的 Tim-3 mRNA 较对照组降低，且 Tim-3与 IκBα、IKKα、IKKβ均呈正相关。提示肿瘤患者的免疫功能与IKKα的相关性更为密切，Tim-3在肿瘤患者中发挥着正性调节作用[8]。

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