东北鹤虱多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

杨 柳 ，王 萌 ，于 跃 ，郭秀英 ，阎 嘉 ，杨凤蕊 ，孟 林

（1.天津医科大学药理学教研室，天津300070；2.北京市天坛生物制品股份有限公司，北京100024）

东北鹤虱（Lappula Echinata Gilib，LEG）为紫草科植物东北鹤虱的果实，盛产于我国华北、东北等地区。药书记载，其味苦、辛、平，入脾、胃、肝三经，可治疗虫积腹痛[1]，民间用其果实或全草水煎治疗各种腹疼、腹泻，尤其对慢性、迁延性腹泻有独到的疗效。已有研究证明其多糖具有抗炎[2]、缓解平滑肌痉挛[3]、调节胃肠水平衡[4]等作用，也有实验表明，其对机体淋巴细胞功能有增强或调节作用[5]。本文将通过观察巨噬细胞（MΦ）体外吞噬、细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌，探讨LEGPS-Ⅱ对MΦ参与免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 东北鹤虱多糖LEGPS-Ⅱ，淡黄色粉末，易溶于水，纯度为38.7%。药物用PBS缓冲液配制成1 mg·mL-1储备液，-20℃冰箱保存，临用前用PBS缓冲液稀释成所需浓度。

1.1.2 试剂 RPMI-1640培养液，北京天润善达生物科技有限公司；超级新生牛血清，美国Gibco公司；注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，生产批号：05091008；四甲基偶氮唑盐（Methyl thiazolyl tetrazole，MTT），瑞士 Fluka 公司；中性红试剂，中奥天元科技发展有限公司。

1.1.3 实验动物及细胞 近交系清洁级BALB/C及昆明种小鼠，体重（20±0.25）g，4～5 周龄，雌雄不拘，购自中国医学科学院放射医学研究所（批准文号：SCXK津2005-0001）。L929细胞株由天津医科大学药学院惠赠。

1.1.4 仪器 Model 680型酶标仪（Bio-Rad）；CK40生物倒置显微镜（Olympus）；Forma SeriesⅡ型二氧化碳孵箱（Thermo Electron Corporation）

1.2 方法

1.2.1 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MΦ吞噬功能的影响 取昆明种小鼠1只，腹腔注射环磷酰胺，每次给药剂量为25 mg·kg-1，连续给药3 d。第3天给药30 min后，将小鼠脱臼处死。无菌条件下常规方法制备腹腔MΦ悬液。另取同窝昆明种小鼠1只制备正常小鼠腹腔MΦ悬液，1640培养液调整细胞密度为2×106mL-1。实验分为正常空白对照组（1640培养液200 μL）、免疫抑制组（1640培养液200 μL）、LEGPS-Ⅱ单独刺激组（1640培养液180 μL 和 0.25～0.03125 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20 μL）、LEGPS-Ⅱ联合ConA刺激组（1640培养液160 μL 和 0.25～0.03125 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20 μL 以及 5 μg·mL-1ConA 20 μL）、ConA 单独刺激组（1640培养液 180μL和5μg·mL-1ConA 20 μL）。孵育 24 h后，吸去各孔上清液，PBS洗掉孔中非粘附细胞，然后加入0.072%的中性红溶液100 μL，孵育4 h。倒置显微镜下观察染色情况。后吸弃上清，用PBS洗掉各孔中未进入细胞的中性红，反复两次。各孔中加入细胞裂解液100 μL，振荡200 s后测OD570nm值。

1.2.2 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MΦ体外分泌IL-1β的影响 取昆明种小鼠同1.2.1的方法建立免疫抑制小鼠模型，并于无菌条件下收集免疫抑制小鼠腹腔MΦ悬液。另取同窝昆明种小鼠，同1.2.1的方法制备正常小鼠腹腔MΦ悬液，用1640培养液调整细胞浓度为2×106mL-1。实验分组同上，其中 LEGPS-Ⅱ单独刺激组 80～20 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20 μL、LEGPS-Ⅱ联合 ConA 刺激组为80～20 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20 μL 以及 5 μg·mL-1ConA 20 μL。孵育48 h，此各孔上清液中即含IL-1β。另取BALB/c小鼠1只脱椎处死，无菌取胸腺，研磨过200目筛网，洗2次，得胸腺单细胞悬液，调细胞密度为2.2×106mL-1，混匀，于96孔板中加入100 μL胸腺细胞悬液。将前述含有IL-1β的待测巨噬细胞上清液以每孔100 μL按对应位置加入到此96孔板胸腺细胞悬液中，孵育48 h。以MTT法测570nm的吸光度值。

1.2.3 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MФ体外分泌TNF-α的影响 取昆明种小鼠同1.2.1的方法建立免疫抑制小鼠模型，并于无菌条件下收集免疫抑制小鼠腹腔MΦ悬液。另取同窝昆明种小鼠，同1.2.1的方法制备正常小鼠腹腔MΦ悬液，用1640培养液调整细胞浓度为2×106mL-1。实验分组同前，其中 LEGPS-Ⅱ单独刺激组80～10μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20μL、LEGPS-Ⅱ联合 ConA 刺激组 80～10 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20μL以及5μg·mL-1ConA20μL。消化、收集L929细胞，加腹腔MΦ培养上清液并以MTT法测570 nm的吸光度值，计算抑制率。

1.3 统计学方法 数据用SPSS17.0统计软件进行处理，结果以±s形式表示。多样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MΦ吞噬功能的影响 在图1中，正常空白对照组的OD值高于免疫抑制组2倍以上，提示免疫抑制小鼠MΦ吞噬能力明显低于正常小鼠，造模成功。结果也显示，单独使用 LEGPS-Ⅱ，在 0.03125~0.25 μg·mL-1范围内，MΦ吞噬能力较免疫抑制组提高，但低于ConA单独刺激组和正常空白对照组；同样剂量范围LEGPS-Ⅱ联合ConA，吞噬能力也较免疫抑制组提高，但仍低于ConA单独刺激组和正常空白对照组。

图1 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MФ吞噬功能的影响(±s,n=6)Fig1 EffectsofLEGPS-Ⅱonphagocytosisofperitonealmacrophage in immunosuppressive mice(±s,n=6)

2.2 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MΦ体外分泌IL-1β的影响 被环磷酰胺免疫抑制后的巨噬细胞处于静止期，几乎不再分泌细胞因子IL-1β。从图2中可以看到，受免疫抑制组上清液中缺乏IL-1β的影响，其OD值较正常空白对照组明显降低，提示免疫抑制小鼠动物模型建立成功；4个LEGPS-Ⅱ单独刺激组对免疫抑制下的MΦ分泌IL-1β无明显增加作用，与免疫抑制组的OD值相比无统计学差异（P>0.05）。经由ConA诱导后，免疫抑制下的MΦ可再次分泌IL-1β，ConA单独刺激组的OD值达到免疫抑制组的 1.41 倍，而 80、60、40、20 μg·mL-14 个剂量组的LEGPS-Ⅱ可以较大地提高被ConA诱导的MΦ分泌IL-1β的水平，并在此药物浓度范围内具有剂量依赖性。

2.3 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MФ体外分泌TNF-α的影响 如图3所示，与免疫抑制组相比，40、80 μg·mL-1这 2 个 LEGPS-Ⅱ单独刺激组的抑制率超过了ConA单独刺激组；而同剂量的LEGPS-Ⅱ联合ConA刺激组与ConA单独刺激组相比明显提高。这说明，LEGPS-Ⅱ可促使静止的和被ConA活化的被免疫抑制的MФ分泌TNF-α的量增加，并具有一定的剂量依赖性。

图2 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MΦ体外分泌IL-1β的影响(±s,n=6)Fig 2 Effects of LEGPS-Ⅱon the cytokine about IL-1β from phagocytosis of peritoneal macrophage in immunosuppressive mice(±s,n=6)

图3 LEGPS-Ⅱ对免疫抑制小鼠腹腔MФ体外分泌TNF-α的影响 (±s,n=6)Fig 3 Effects of LEGPS-Ⅱon the cytokine about TNF-α from phagocytosis of peritoneal macrophage in immunosuppressive mice(±s,n=6)

3 讨论

本实验研究了LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔MΦ的体外吞噬能力及对IL-1β和TNF-α分泌的影响。实验结果显示，LEGPS-Ⅱ在 0.03125～0.25 μg·mL-1范围内可使静止的以及被ConA[6]诱导激活的免疫抑制小鼠的腹腔MΦ吞噬能力增加，并具有剂量依赖性。同时实验结果也显示，ConA单独刺激MΦ的吞噬能力高于LEGPS-Ⅱ各剂量组，两者合用并没有表现出联合作用，反而使单用ConA时的作用减弱，小剂量LEGPS-Ⅱ即可表现出对ConA作用的拮抗，随着浓度增加而逐渐增强，由此提示，LEGPS-Ⅱ有可能在MΦ表面有结合位点，而且部位与ConA在MΦ表面的丝裂原受体接近或重叠，因此表现出竞争性抑制，但这点有待于进一步实验证实。被活化MΦ的吞噬能力呈现出对LEGPS-Ⅱ的剂量依赖性，当LEGPS-Ⅱ的浓度不断加大，其转为向下调节被活化MΦ的吞噬能力，这有可能对发生过度非特异免疫应答起到一定的保护作用。

LEGPS-Ⅱ并不能单独刺激已被免疫抑制的MΦ分泌更多的IL-1β[7]，但此MΦ被ConA激活后，20~80 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ则可促进其分泌 IL-1β，并且均高于ConA单独刺激的效果，表现出剂量依赖性。因此分析，LEGPS-Ⅱ对活化的巨噬细胞分泌IL-1β的促进作用更明显，而对免疫抑制的静止巨噬细胞效果欠佳，增大LEGPS-Ⅱ的剂量亦不能使巨噬细胞IL-1β分泌增加。推测在病原体感染（此时巨噬细胞被病原体激活）或其他刺激原存在情况下，LEGPS-Ⅱ可能对于正常个体或免疫功能抑制个体具有较好的上调IL-1β水平的作用，进而上调巨噬细胞非特异免疫功能，提高机体的防病、抗病能力。对于免疫抑制的静止巨噬细胞，较大剂量的LEGPS-Ⅱ可以明显地增加TNF-α的产生[8]，而对于免疫抑制的活化巨噬细胞，各个剂量的LEGPS-Ⅱ均可以促使其分泌TNF-α增多。由此可见，处于免疫抑制状态下的静止巨噬细胞对LEGPS-Ⅱ敏感度低，需要增大LEGPS-Ⅱ的浓度才能刺激巨噬细胞更多地分泌TNF-α，而当免疫抑制状态的巨噬细胞被激活，LEGPS-Ⅱ使TNF-α的分泌量增加，且与ConA有联合作用。

从以上LEGPS-Ⅱ对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫功能调节实验中可以看到，LEGPS-Ⅱ可以增加免疫抑制条件下静止的、活化的巨噬细胞的体外吞噬能力，以及TNF-α的生成能力；促进免疫抑制条件下活化的巨噬细胞体外分泌IL-1β。

［1］冉先德.中华药海[M].哈尔滨:哈尔滨出版社，1987:1062-1064

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［4］孟林，周晶，尹永强，等.东北鹤虱中平滑肌松弛作用有效部位的筛选[J].天津医科大学学报,2002,8(3):279

［5］于跃，杨柳，郭秀英，等.东北鹤虱水提取物对小鼠脾淋巴细胞体外增殖、分泌IL-2和TNF-α的作用[J].天津医科大学学报，2010，16(3):424

［6］窦肇华，张远强，郭顺根.免疫细胞学与疾病[M].北京:中国医药科技出版社,2004:236-245

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