胃癌手术前后外周血CD4+CD25+调节性T细胞的变化及临床意义

邱宇杰，侯计平，李富新，李卫东

（1.天津医科大学总医院普通外科，天津普通外科研究所，天津300052；2.天津市宝坻区人民医院普通外科，天津 301800）

世界范围内最常见恶性肿瘤中胃癌排第4名[1]。根据流行病学调查表明，日本、美国的胃癌发病率今年呈持续下降趋势，但我国仍属于胃癌高发国家。目前，胃癌的治疗以手术为主，但由于胃癌诊断时病期已偏晚，外科治疗的疗效不够满意。大量研究已表明恶性肿瘤的发生、发展与多种因素有关，其中包括机体的免疫功能失衡，在此状态下，肿瘤细胞逃避免疫细胞监控，发生免疫逃逸，最终导致肿瘤发生[2]。肿瘤的免疫内环境在肿瘤的形成发展过程中起到关键性作用。因此阐明肿瘤的发生、发展及预后与机体的免疫功能状态的关系，可利于建立新的治疗方法[3]。本研究目的旨在探索胃癌CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的变化特征及其与临床指标之间的关系，为新的治疗方法提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 对象 在取得患者知情同意后，以天津医科大学总医院普外科2007年10月至2009年4月期间初治行手术切除治疗的胃癌患者共38例作为研究对象，其中男性26例，女性12例，年龄43～85岁，中位年龄为56.00岁，平均年龄（60.13±11.50）岁。收集每一例病人的临床资料，所有切除标本术后均得到病理学证实。同期随机收集在我院进行体检的健康者20例作为正常对照组，其中男性13例，女性7例，年龄40～78岁，中位年龄54.00岁，平均年龄（58.50±11.02）岁，并且所有受检者外周血中生化和免疫指标均正常。两组间性别和年龄经统计学分析无显著性差异（P>0.05），具有可比性。

1.2 材料 鼠抗人CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Per－CP、CD4-PerCP、CD25-FITC 单克隆抗体、红细胞裂解液均为Becton Dickinson公司产品；4%多聚甲醛为武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.3 免疫功能检测 抽取胃癌组术前3 d、术后14 d以及正常对照组外周血，所有受试者外周血标本均在清晨空腹下抽取，血液标本均在抽血后6 h之内处理。血标本以CD4-PerCP、CD25-FITC单克隆抗体及CD4-FITC、CD8-PE、CD3-perCP单克隆抗体分别对CD4+CD25+调节性T细胞及CD3+CD4+CD8+T细胞亚群进行标记并进行流式细胞学检测。所有受试者未进行过影响机体免疫状态的任何干预，包括放射治疗、化疗以及生物治疗。

1.4 统计学处理 实验结果应用SPSS15.0统计分析软件包处理。两独立样本非参数检验应用Mann-Whitney Test，两相关样本非参数检验应用Wilcoxon one-sample方法，完全随机设计多组样本非参数检验比较应用Kruskal-Wallis Test，描述两样本相关性应用Spearman’s秩相关检验。检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 胃癌患者外周血Treg、CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达

2.1.1 胃癌患者外周血Treg的表达 胃癌患者术前外周血Treg比例显著高于正常对照组，差异具有统计学意义；手术后外周血Treg比例与正常对照组比较，差异无统计学意义（表1）。胃癌患者术前外周血Treg比例显著高于术后比例，差异具有统计学意义（表 2）。

表1 胃癌患者手术前、后与对照组外周血Treg、CD4+T及CD8+T细胞比例的比较*Tab 1 Comparisons of Treg,CD4+T cell and CD8+T cell between gastric cancer patients of pre-and post-operation and control

表2 胃癌患者手术后与手术前外周血Treg、CD4+T及CD8+T细胞比例的比较*Tab 2 Comparisons of Treg,CD4+T cell and CD8+T cell between gastric cancer patient of pre-and post-operation

2.1.2 胃癌患者外周血CD4+T细胞的表达 胃癌患者术前外周血CD4+T细胞比例与正常对照组相比，两者之间差异无统计学意义；胃癌患者术后外周血CD4+T细胞比例与对照组比较，两者之间差异无统计学意义（表1）。胃癌患者术后外周血CD4+T细胞比例与术前比较，两者之间差异无统计学意义（表 2）。

2.1.3 胃癌患者外周血CD8+T细胞的表达 胃癌患者术前外周血CD8+T细胞比例明显低于正常对照组，差异具有统计学意义；胃癌患者术后外周血CD8+T细胞比例与正常对照组比较，两者之间无统计学差异（表1）。胃癌患者术后外周血CD8+T细胞比例明显高于术前，差异具有统计学意义（表2）。

2.2 相关性分析

2.2.1 胃癌患者术前外周血Treg比例在不同淋巴结转移情况和TNM分期之间差异具有统计学意义（P<0.05）（表3），其与淋巴结转移和TNM分期呈正相关，相关系数分别为 0.521、0.533，P值均为0.001，与肿瘤浸润深度、远处转移、肿瘤分化程度及病理类型均无相关性（P>0.05）。Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者外周血中Treg比例显著高于Ⅰ期，差异具有统计学意义（P<0.008），Ⅳ期胃癌患者外周血中Treg比例亦显著高于Ⅱ期，差异具有统计学意义（P<0.008），其它各分期之间胃癌患者外周血中Treg比例差异无统计学意义（P>0.008）。

2.2.2 胃癌术前术后外周血中Treg比例下降程度与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、分化程度、病理分型以及手术方式均无相关性（P>0.05）。

2.2.3 胃癌患者术前、术后外周血CD8+T细胞比例与Treg比例呈负相关（表4）。

表3 有无淋巴结转移、不同TNM分期之间胃癌患者术前外周血中Treg比例的比较Tab 3 Comparisons of Treg between different status of lymph node metastasis and TNM staging of gastric cancer patients

表4 胃癌患者手术前、后外周血Treg、CD8+T细胞比例的关系*Tab 4 Relationship between Treg and CD8+T cell of gastric cancerpatients of pre-operation and post-operation

3 讨论

1995年，Sakaguchi等[4]首次分离获得CD4+CD25+调节性T细胞亚群。随着分子生物学的飞速发展，Treg作用机制逐渐被阐明，其调节功能在机体免疫稳态维持、移植耐受、肿瘤免疫、过敏反应及微生物感染等方面均得到了证实。正常状态下，Treg调节正在进行的免疫反应和Treg的数量，预防自身免疫功能失调。其数量和功能的增高或减低，必然相应地导致免疫抑制（例如肿瘤或感染）或自身免疫（例如多发性硬化症）[5]。大量的研究已表明恶性肿瘤的发生、发展与多种因素有关，其中包括机体的免疫功能失衡。近年研究发现，Treg在多种肿瘤患者的外周血和肿瘤组织中均有增高，提示肿瘤细胞可以产生一系列逃避抗肿瘤反应的机制，肿瘤患者体内Treg数量的增高即是抑制肿瘤免疫的机制之一，体外的试验也表明Treg能够抑制CD8+T细胞的增殖，提示该类细胞可能为肿瘤细胞的生长提供一个良好的环境，促进肿瘤的发展。在此状态下，肿瘤细胞逃避免疫细胞监控，发生免疫逃逸，最终导致肿瘤发生[2]。

Treg在机体内维持一定的比例，在健康人外周血中能够监测到Treg，其比例可在一定程度上反映机体的免疫状态。本文正常对照组结果为（4.56±3.03）%，该比例指的是其群细胞与T淋巴细胞的比例，和文献报道相一致，可以作为深入研究的对照基础。Anna等[6]研究了42例不同上皮细胞来源的恶性肿瘤患者及健康人外周血的CD4+CD25+Treg分布情况，结果发现肿瘤患者外周血的CD4+CD25+Treg均有升高，而健康对照组未见升高。Shah等[7]研究了40例宫颈癌标本，CD4+CD25+Treg的高表达即意味着明显下降的生存率。本文结果经统计学分析表明，胃癌患者术前外周血中Treg比例显著高于对照组（P<0.01），而术后外周血中Treg与对照组无显著差异；淋巴结转移阳性胃癌患者术前外周血中Treg比例高于淋巴结转移阴性患者（P<0.01）。胃癌患者外周血中Treg比例与淋巴结转移呈正相关；各TNM分期之间胃癌患者术前外周血中Treg比例有显著差异（P<0.05），进一步行各TNM分期之间两两比较发现，Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者术前外周血中Treg比例均较Ⅰ期显著增加（P<0.008），Ⅳ期胃癌患者术前外周血中Treg比例亦显著高于Ⅱ期（P<0.008），表明Treg比例的增高使机体产生肿瘤免疫耐受，抑制机体的抗肿瘤免疫，最终导致肿瘤的发生。Treg比例在一定程度上反映疾病的进展情况，甚至能作为检测疾病进展的免疫学指标。

本文结果显示胃癌患者术前外周血中CD4+T细胞比例与对照组无显著差异（P>0.05），说明CD4+T细胞不是影响肿瘤免疫的主要因素，而是其亚群Treg细胞参与肿瘤的免疫耐受，影响肿瘤的发生、发展。另一方面，胃癌患者术前外周血中CD8+T细胞比例明显降低，且胃癌患者术前外周血CD8+T细胞比例与Treg比例呈负相关，术后外周血CD8+T细胞比例与Treg比例亦呈负相关，即随着Treg比例的升高，CD8+T细胞比例下降。CD8+T细胞是主要的肿瘤免疫作用细胞之一，而肿瘤患者的这种细胞往往功能低下数量减少。提示Treg通过抑制CD8+T细胞的增殖以及抑制CD8+T细胞对癌细胞的细胞毒性作用，从而能够促进癌细胞的生长和进展。Li等[8]利用抗CD25抗体去除小鼠体内的Treg，实验结果显示Treg数量减少达到90%以上时可诱导抗肿瘤反应的一系列过程，其中包括肿瘤特异性CD8+T细胞的激活以及浸润肿瘤的CD8+T细胞数量的增多。

本文结果显示胃癌患者外周血中Treg比例及其变化在不同肿瘤浸润深度、远处转移、分化程度及病理类型间无显著差异，这一结果说明以上情况不是影响胃癌患者Treg比例的主要因素。胃癌术前术后外周血中CD4+CD25+Treg比例差值在不同浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期之间的差异无统计学意义。另外，根治性手术胃癌患者术前术后外周血中CD4+CD25+Treg比例差值与姑息性手术比较，差异亦无统计学意义（P>0.05）。这提示无论肿瘤分期、分化程度、组织类型、原发灶深度及淋巴结转移情况如何，能否行根治性手术，只要去除肿瘤本身，就可以使外周血中CD4+CD25+Treg比例下降。这也从另一方面阐明切除肿瘤有助于CD4+CD25+Treg比例下降，从而改善机体的抗肿瘤免疫能力。

本文结果提示Treg可能通过抑制CD8+T细胞的增殖及功能，促进肿瘤细胞的生长和发展，这可能是肿瘤患者免疫功能受到抑制的机制之一。去除肿瘤本身，Treg比例显著降低，可以改善机体的抗肿瘤免疫能力，也说明了肿瘤本身在Treg细胞生成、增殖及聚集过程中起着重要作用。实验结果显示Treg与肿瘤的侵袭、淋巴结转移有关，提示Treg在一定程度上可作为检测疾病进展的免疫学指标。

［1］Conroy H,Marshall NA,Mills KH.TLR ligand suppression or enhancement of Treg cells?A double-edged sword in immunity to tumours[J].Oncogene,2008,27(2):168

［2］Ho PP,Steinman L.The aryl hydrocarbon receptor:a regulator of Th17 and Treg cell development in disease[J].Cell Res,2008,18(6):605

［3］Kamangar F,Dores GM,Anderson WF.Pattern of cancer incidence,mortality,and prevalence across five continents:Defining priorities to reduce cancer Disparities in Different Geographic Regions of the World[J].J Clin Oncol,2006,24(14):2137

［4］Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of selftolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1151

［5］Cools N,Ponsaerts P,Van Tendeloo VF,et a1.Regulatory T cells and human disease[J].Clin Dev Immunol,2007,2007:89195

［6］Anna MW,Dominik W,Michael S,et al.Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients[J].Clin Cancer Res,2003,9(2):606

［7］Shah W,Yan X,Jing L,et al.A reversed CD4/CD8 ratio of tumorinfiltrating lymphocytes and a high percentage of CD4(+)FOXP3(+)regulatory T cells are significantly associated with clinical outcome insquamouscellcarcinomaofthecervix[J].CellMolImmunol,2010,8(1):59

［8］Li X,Kostareli E,Suffner J,et al.Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors[J].Eur Immunol,2010,40(12):3325