高压氧治疗对正常及SIRS大鼠脾细胞凋亡的影响

中国医科大学附属第一医院急诊科(110001) 葛百平 赵宝宝 冯 芳 王 钢

作者:葛百平，中国医科大学急诊科研究生在读，现工作单位沈阳急救中心。

导致系统性炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能衰竭(MODS)发生的主要诱因几乎能诱发所有类型细胞的凋亡[1-2]，免疫炎症细胞凋亡紊乱及靶器官细胞大量凋亡的结果也可能是SIRS/MODS发生发展的因素之一[3-7]。SIRS的发生发展过程中有多种因素可以启动细胞凋亡。目前的研究认为，免疫细胞的大量凋亡是SIRS状态下免疫功能低下的重要原因。高压氧(HBO)治疗应用于SIRS状态下的研究目前主要集中于炎症、缺血/再灌注损伤等方面。而HBO对SIRS状态免疫功能影响方面的研究比较少见。HBO治疗指的是在2～3ATA(1ATA=101.325kPa)下给 100%的 O2，使动脉血氧分压(PaO2)达2000mmHg(1mmHg=0.133kPa)，组织血氧分压达400mmHg。HBO是一氧化碳中毒、减压病和动脉气体栓塞首选治疗方法，在放射性骨病、梭状芽孢杆菌性肌坏死、难治性骨髓炎等疾病和皮肤移植中的疗效也被充分肯定[8]，目前关于其在严重创伤或感染导致的SIRS状态下的应用也逐步探索。脾脏作为机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，在对临床患者的研究中表明，SIRS患者存在明显的脾脏淋巴细胞凋亡的增加[9]。本实验就正常及SIRS状态下的大鼠脾细胞凋亡为对象，研究HBO治疗对于正常及SIRS状态下机体的免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性SD大鼠50只，购自中国医科大学实验动物中心，体重约140～180g，随机分为5组，每组10只。A组:腹腔注射等量生理盐水;B组:腹腔注射等量生理盐水，做3次HBO;C组:腹腔注射酵母多糖-石蜡悬液(500mg/kg);D组:腹腔注射酵母多糖-石蜡悬液(500mg/kg)，做1次HBO;E组:腹腔注射酵母多糖-石蜡悬液(500mg/kg)，做3次HBO。

1.2 主要试剂、仪器 酵母多糖-A(Sigma公司);AnnexinV-FITC凋亡检测试剂/试剂盒(Biovison公司);流式细胞仪，DWC400A/02-1型动物HBO舱。

1.3 大鼠SIRS模型建立 将酵母多糖粉剂和无菌液体石蜡混合，高频振荡15分钟，100℃水浴80分钟灭菌，制成浓度为100mg/mL的酵母多糖A-石蜡混悬液，存放于4℃备用。临用前40℃ 水浴复温，高频振荡15分钟后供注射。大鼠实验前18小时开始禁食，不禁水。C、D、E组以500mg/kg体重予大鼠腹腔注射酵母多糖A-石蜡悬液，A、B组注射等量生理盐水。

1.4 HBO治疗方案 1次HBO的时间为腹腔注射后4小时，3次HBO的时间分别为腹腔注射后4小时、10小时、18小时。每次 HBO都遵循以下方案:100%纯氧洗舱5分钟，以清除舱内原有空气。匀速加压至2ATA(15分钟)，用已校对的测氧仪测舱内氧浓度达90%以上，期间以4L/min的速度持续通O2避免CO2蓄积，并将压力维持在2ATA。1小时后以同样速度匀速减至常压，出舱。

1.5 标本采集及检测 腹腔注射24小时后，标记大鼠顺序杀鼠取脾、标号，脾脏剪至糊状，100目筛滤过(加PBS)，离心1000rpm10分钟，弃上清，低渗休克法溶解红细胞，RPMI1640调整细胞浓度1×106/mL，取上述液体0.1mL进行如下步骤:4℃离心10分钟，弃上清，加入冷PBS1mL，轻轻震荡，于4℃下1000rpm离心10分钟，弃上清，重复2次，加200μL Buffer，加 10μLAnnexinV-FITC，加 PI10μL，置于25℃，15 分钟，加300μLBuffer，30 分钟内上机检测，以上按照AnnexinV-FITC凋亡检测试剂/试剂盒说明书操作。

1.6 统计方法 用SPSS18.0forWindows软件分析数据。各组数值用均数±标准差表示，采用One-WayANOVA方法，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 大鼠SIRS模型建立效果 腹腔注射酵母多糖-石蜡溶液组大鼠呼吸急促，伴有明显喘鸣，皮肤黏膜发绀，出汗，毛色灰暗，部分大鼠有鼻出血，腹胀，腹泻。大鼠进食明显减少，活动差，对外界刺激无反抗。杀鼠后，见SIRS组大鼠腹腔渗出增多，肠管扩张，程度不一。肝脏呈暗红色或暗紫色。肺脏可见不同程度肿胀，部分可见充血出血点。心脏、肾脏、脾脏、胰腺无明显大体改变。

2.2 HBO治疗的影响

2.2.1 HBO对正常脾细胞凋亡的影响 在本次实验中，经过HBO治疗的大鼠脾细胞凋亡有增加，但与正常组相比较，差异无显著性(P＞0.05)。

2.2.2 SIRS状态对大鼠脾细胞凋亡的影响 在本实验中，SIRS状态下大鼠脾细胞的凋亡率比对照组有明显升高(P ＜0.05)。

2.2.3 HBO对 SIRS大鼠脾细胞凋亡的影响 在SIRS组中，HBO显示了明显的作用，无论是1次HBO组，还是3次HBO组，凋亡率均明显减少(P＜0.05)，但此实验中，1次 HBO组和3次HBO组并未发现有明显差异(P＞0.05)。各组脾细胞凋亡比例分别是A组(13.30±8.94)%;B组为(16.25±11.24)%;C 组为(25.40 ±4.17)%;D 组为(12.91 ±3.67);E 组为(15.97 ±4.27)%。各组间比较，B组与A组比较，P ＞0.05;C组与A、B组比较，P＜0.05;D组、E组与C组比较，P＜0.05;D组与E组比较，P ＞0.05。

各组脾细胞凋亡比例的比较，见图1。

图1 各组脾细胞凋亡比例的比较

3 讨论

SIRS概念是上世纪90年代提出，经10余年的研究探索，发现从感染、创伤等病因发展到MODS的过程中，都存在着一条共同通路，即SIRS。SIRS具有以下特征:1)体温＞38℃或＜36℃。2)心率＞90次/分。3)呼吸 ＞20次/分或 PaCO2＜32.33mmHg。4)血白细胞 ＞12×109/L或＜4 109/L，或未成熟粒细胞＞103。具备上述表现2种或以上可确认为SIRS，上述标准后于2001年增加了炎症指标及高排低阻的血液动力学指标，白细胞介素-6(IL-6)达 279 ～ 5979pg/L 被 认为 存 在 SIRS[10]。Bone将典型的SIRS分成5个时期:第1期为局部炎症反应期，炎症反应局限于感染或损伤局部;第2期为全身炎症反应始动期，早期的促炎及随后的抗炎介质进入体循环;第3期为全身炎症反应期，机体出现失去控制的，自我持续放大和自我破坏的炎症，表现为播散性炎细胞活化、炎症介质泛滥形成瀑布效应，并由此引起远隔部位的炎症反应，引起组织损伤。第4期为代偿性抗炎反应综合征(CARS)期，抗炎反应过度，导致免疫功能抑制及对感染的控制和抵抗能力下降;第5期为免疫不协调期，表现为多脏器功能失调，病死率高，即MODS[11-12]。失控的炎症反应导致的免疫功能失调是SIRS状态的特点。

细胞凋亡又被称为程序性细胞死亡(PCD)，是一种重要的生命现象，不仅出现在生理情况下，更与肿瘤、自身免疫性疾病及退行性神经病变等多种疾病密切相关。在近年来的研究中，细胞凋亡在SIRS到MODS的发生发展的过程中备受关注[13]。

SIRS状态下，机体处于强烈应激状态，全身血流重新分布，胃肠、肝胆系统、肾脏甚至肺脏血管强烈收缩，内脏缺血缺氧。持续的缺氧，长时间的高浓度儿茶酚胺刺激，内源性阿片肰对肾上腺能受体(AR)的抑制等原因，使全身的AR敏感性降低甚至失敏，此时内脏血管重新开放，造成内脏组织的缺血再灌注损伤(IR)，自由基、炎症介质及细胞因子并大量释放，内脏瘀血缺氧，微循环障碍，细胞能量代谢障碍[14]。众所周知，这些因素都可以导致免疫细胞和实质细胞凋亡，免疫细胞大量凋亡的结果会导致免疫功能低下[7，15]，实质细胞的凋亡则产生器官功能障碍[16]。

有研究证实，线粒体是缺血、缺氧损害的核心靶细胞器，线粒体损害是全身性缺血、缺氧损害的最关键环节。近年来的研究表明，细胞凋亡过程中，线粒体起到了至关重要的作用。线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心，与凋亡相关的很多关键事件都发生于线粒体，在凋亡的线粒体途径中，线粒体上的线粒体通透性转变孔道(PT孔道)被认为是细胞的生死开关，PT孔开放会引起线粒体跨膜电位ΔΨm下降和细胞色素C释放，一旦线粒体跨膜电位因能量代谢障碍而耗散，细胞将进入不可逆的凋亡[17-18]。

HBO对机体SIRS状态的治疗作用是系统而不是局部的增加氧张力，提高氧分压，可以改变血流携氧方式，以物理溶解的方式向缺血组织供氧，增加氧的弥散距离，甚至能够到达因微循环阻塞而红细胞不能到达的组织，从而改善微循环，改善缺血、缺氧组织血供，甚至可以使组织达到无血存活。研究显示，HBO治疗可以减少致炎介质的数量，有明显的抗炎作用。HBO治疗酵母多糖诱导休克的大鼠实验研究证实，HBO治疗减少SIRS状态下TNF-alpha分泌[19]。创伤失血性休克复苏后大鼠肠道组织TNF-alpha水平明显升高，HBO治疗显著降低TNF-alpha水平，抑制过度炎症反应[20]。Kaelin等在鼠游离皮瓣移植应用HBO处理的研究中发现，SOD活性明显升高，从而减少氧自由基。HBO治疗能够改善缺血、缺氧组织的供氧，阻断细胞能量代谢障碍，稳定线粒体跨膜电位 ΔΨm[21]。

本实验结果显示，SIRS状态下脾细胞凋亡明显增加(P ＜0.05)，而HBO治疗显著降低了SIRS状态下大鼠脾细胞凋亡(P＜0.05)。HBO治疗1次与3次组并未有明显差异(P ＞0.05)，这说明HBO治疗能减少SIRS状态下的脾细胞凋亡，且这种作用不依赖于暴露的剂量和时间。HBO治疗减少脾细胞凋亡可能的机制，首先是HBO治疗能改善机体缺血缺氧，改善微循环，保证能量代谢，维持 ATP水平，阻止线粒体损伤，防止细胞凋亡;其次HBO治疗有抑制过度的炎症反应作用，减少TNF-alpha等炎症介质，从而抑制脾细胞凋亡;再次，HBO治疗可能通过减少自由基的产生，抑制生物膜的脂质过氧化，从而阻断细胞的凋亡过程。

研究结果[23-25]，给予HBO治疗，可以导致自由基产生，随后SOD活性反应性的升高，结果导致总体上自由基减少，但随着治疗剂量的增加，SOD的耗尽，自由基产生会再次增加。因此，HBO治疗应用于临床，其治疗时机、剂量，以及治疗中抗氧化剂的应用等都需要进一步研究。目前关于HBO治疗能否阻断SIRS状态发展到MODS的研究已经有所开展，本实验表明HBO治疗在这方面有广阔的前景。

[22]

[1] 许永华，杨兴易.危重病的细胞凋亡发生机制及其治疗前景[J].急救医学杂志，2003，23(6):407

[2] 许国根，王弋，缪群，等.全身炎症反应综合征患者抗炎因子对T淋巴细胞凋亡的影响[J].中华急诊医学杂志，2002，11(4):249

[3] Cantaluppi V，Assenzio B，Pasero D，et al.Polymyxin-B hemoperfusion inactivates circulating proapoptotic factors[J].Intensive Care Med，2008，34(9):1638

[4] Mariano F，Cantaluppi V，Stella M，et al.Circulating plasma factors induce tubular and glomerular alterations in septic burns patients[J].Crit Care，2008，12(2):42

[5] Kucklebrug CJ，Tiwari R，Czuprynski CJ.Endothelial cell apoptosis induced by bacteria-activated platelets requires caspase-8 and-9 and generation of reactive oxygen species[J].Thromb Haemost，2008，99(2):363

[6] Gambim MH，Carmo Ade O，Marti L，et al.Platelet-derived exosomes induce endothelial cell apoptosis through peroxynitrite generation:experimental evidence for a novel mechanism of septic vascular dysfunction[J].Crit Care，2007，11(5):107

[7] Hotchkis RS，Chang KC，Gmyson MH，et al.Adoptive transfer of apoptotic splenocytes worsens survival，whereas adoptive transfer of necrotic splenoeytes improves survival in sepsis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(11):6724

[8] Al-Waili NS，Butler GJ，Petrillo RL，et al.Hyperbaric oxygen and lymphoid system function:A review supporting possible intervention in tissue transplantation[J].Technol Health Care，2006，14(6):489

[9] Hotchkiss RS，Tinsley KW，Swanson PE，et al.Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+T lymphocytes in humans[J].J Immunol，2001，166(11):6952

[10] Levy MM，Fink MP，Marshall JC，et al.2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS international sepsis definitions conference[J].Crit Care Med，2003，31(4):1250

[11] Martignoni A，Tschep J，Goetzman HS，et al.CD4-expressing cells are early mediators of the innate immune system during sepsis[J].Shock，2008，29(5):591

[12] 黄志英.感染性休克研究进展[J].中国卫生检验杂志，2009，19(3):709

[13] Hotchkiss RS，Swanson PE.Apoptotic cell death in patients with sepsis，shock and multiple organ dysfunction[J].Crit Care Med，1999，27(7):1230

[14] 龙晓弘，赵晓琴.多器官功能障碍综合征发病机制研究进展[J].蛇志，2007，19(2):145

[15] Wesche DE，Lomas-Neira JL，Perl M，et al.Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock[J].J Leukoc Biol，2005，78(2):325

[16] Hori Y，Takeyama Y，Ueda T，et al.Macrophage-derived transforming growth factor-beta1 induces hepatocellular injury via apoptosis in rat severe acute pancreatitis[J].Surgery，2000，127(6):641

[17] 梁晚益，黄跃生，杨宗城.严重烧伤早期心肌线粒体磷脂变化及其机制[J].中华创伤杂志，2001，17(7):416

[18] 谢燕，朱光旭，江海洪，等.缺氧-复氧对心肌细胞NRF1与mt2TFR表达的影响[J].第三军医大学学报，2001，23(12):1399

[19] Yamada T，Taguchi T，Hirata Y，et al.The protective effect of hyperbaric oxygenation on the small intestine in ischemia-reperfusion injury[J].J Pediatr Surg，1995，30(6):786

[20] 金立方，王为成，王钢.HBO防止创伤/失血性休克复苏后大鼠肠道缺血-再灌注损伤[J].中华急诊医学杂志，2009，18(11):1183

[21] Kaelin CM，Im MJ，Myers Ra，et al.The effects of hyperbaric oxygen on free flaps in rats[J].Arch Surg，1990，125(5):607

[22] Kudchodkar B，Jones H，Simecka J，et al.Hyperbaric oxygen treatment attenuates the pro-inflammatory and immune responses in apolipoprotein E knockout mice[J].Clin Immunol，2008，128(3):435

[23] Buras JA，Holt D，Orlow D，et al.Hyperbaric oxygen protects from sepsis mortality via an IL-10-dependent mechanism[J].Crit Care Med，2006，34(10):2624

[24] Chen MF，Chen HM，Ueng SWN，et al.Hyperbaric oxygen pretreatment attenuates hepatic reperfusion injury[J].Liver，1998，18(2):110

[25] G Thom S.Functional inhibition of leukocyte b2 integrins by hyperbaric oxygen in carbon monoxide-mediated brain injury in rats[J].Toxicol Appl Pharmacol，1993，123(2):248