腹膜功能退化的病理生理学基础

伏幼娟 张庆燕 综述 俞雨生 审校

腹膜透析(PD)是治疗终末期肾病(ESRD)患者重要的手段之一。过去20年，PD无论是技术(如外接口改良)，透析方式(如自动化腹膜透析机)，还是PD液都发生了较多改进，使腹膜炎发生率明显下降、PD患者生存期延长。然而，感染以及接触PD液所带来的腹膜功能退化仍是长期PD患者面临的主要问题。目前高达50%的PD患者正经历着腹膜纤维化、血管生成及血管退化等导致腹膜溶质转运增加、超滤减少的并发症。为寻求更好的治疗方法，减少感染等所导致的腹膜损伤、延长腹膜生存时间、改善PD患者的长期预后，必须了解腹膜功能退化的病理生理学基础。

腹膜炎症时分子生物学变化

腹膜炎症时最早出现局部白细胞浸润，在炎症 12～24h 内以中性粒细胞聚集为主， 然后中性粒细胞逐渐被清除，代之以单核细胞、巨噬细胞及淋巴细胞。白细胞这种短暂的募集反应是一种机体自我保护机制。在其他炎症组织中，白细胞介素6(IL-6)可抑制中性粒细胞的聚集，但腹膜炎时，IL-6则是关键的细胞因子，IL-6与可溶性IL-6受体(sIL-6R)结合，形成配体-受体复合物，通过信号传导分子重组人糖蛋白130(gp130)发挥调节作用。通过这种方式，IL-6/sIL-6R复合物调节特定细胞因子、黏附分子的表达，并调节细胞凋亡，从而影响白细胞的募集反应(图1)[1-4]。这一过程由腹腔间皮细胞产生趋化因子开始，炎症反应过程中，间皮细胞可激活促炎因子驱动，合成大量IL-6[5]；但间皮细胞不合成IL-6R，只有存在IL-6/sIL-6R复合物时，才能调节趋化因子的合成(图1)[2]。

图1 IL-6和sIL-6R信号对白细胞转运的调节

Hurst等[2]以表皮葡萄球菌产生的上清液建立鼠腹膜炎模型，阐明了其炎性反应过程：首先促炎因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1、γ干扰素(IFN-γ)激活，随后趋化因子表达、中性粒细胞迅速募集，紧接着单核细胞取代中性粒细胞。综合临床研究及体外去IL-6鼠模型的实验研究表明，促炎因子驱动的表达触发中性粒细胞聚集，随后中性粒细胞释放sIL-6R，和IL-6结合形成IL-6/sIL-6R复合物。IL-6/sIL-6R复合物抑制CXC趋化因子的进一步表达，保证中性粒细胞的清除，同时促进CC趋化因子的分泌，如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和正常T淋巴细胞表达和分泌的活性调节蛋白(RANTES)，触发单核细胞募集[2]。去IFN-γ小鼠模型的实验研究表明，IFN-γ通过影响IL-6和IL-1β，也参与了中性粒细胞的募集调控，同时可促进中性粒细胞的凋亡及清除[3]。McLoughlin等[4]通过建立gp130基因突变小鼠模型显示，IL-6/sIL-6R复合物形成后，通过信号传导分子gp130以及STAT1/3实现信号传导，激活通路，选择性促进T淋巴细胞在腹膜中募集。这些研究阐明了IL-6及SIL-6R在急性炎症反应中的作用，揭示了先天免疫向获得性免疫的转变有利于清除腹膜的细菌感染、消除炎症，而反复感染或慢性炎症时，容易发生该通路的调节失衡，导致腹膜损伤，从而为寻找减轻炎症反应、促进细菌感染清除的有效措施提供证据。

Kato等[6]研究表明腹膜间皮细胞(MPMC)表达的Toll样受体4(TLR4)在炎症反应起始过程中也起了重要作用。他们分别从C3H/HeN(野生型；LPS敏感)及C3H/HeJ(LPS不敏感)小鼠中获得MPMC的培养，发现脂质A刺激MPMC产生MCP-1和巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)依赖于TLR4，接受脂多糖(LPS)刺激后，C3H/HeN小鼠腹腔的白细胞募集、MCP-1和MIP-2的产生明显高于C3H/HeJ小鼠。可见，TLR4直接影响间皮细胞趋化因子的产生，TLR4介导的信号通路可以减轻腹膜炎症反应对腹膜的破坏。最近研究发现，可溶性TLR2可调节腹膜的炎症反应及白细胞的募集，但不影响细菌的清除[7]。这些数据表明，抑制炎症而不影响腹膜自身防御能力的治疗措施有望成为现实。

腹膜炎症对腹膜转运的影响

急性腹膜炎时，内皮交换面积增大，小分子溶质、葡萄糖转运增加，蛋白质丢失进入PD液，导致渗透梯度下降，从而使超滤失败。整个过程中，炎性反应中所释放的血管活性物质，尤其是NO发挥了重要作用。在腹膜炎鼠模型中，应用左旋硝基精氨酸甲酯抑制一氧化氮合成酶(NOS)可增加超滤，降低血管通透性[8]。根据NOS在腹膜的表达程度不同分三个亚型：神经NOS(nNOS，NOS1)，可诱导NOS(iNOS，NOS2)及内皮NOS(eNOS，NOS3)[9]。

nNOS和eNOS为构成型亚型，其活性受细胞内钙离子水平控制，而iNOS的表达由LPS或细胞因子激活。通过建立NOS亚型缺乏的小鼠腹膜炎模型表明，NO在急性腹膜感染或炎症引起的结构、转运改变的过程中发挥了重要作用。在导管相关的革兰阳性球菌性腹膜炎模型中，eNOS的缺失可以明显减轻血管增生和炎性浸润，从而改善超滤，减少血中蛋白丢失进入PD液(图2)[10]。Ni等[11]以LPS诱导建立腹膜炎模型，通过对不同亚型NOS缺失的观察，进一步证实了eNOS缺失可改善腹膜炎时的溶质转运增加及超滤下降，而nNOS和iNOS却不能。相反，iNOS缺失的小鼠接受LPS后的炎症反应更重，死亡率更高。这些数据都表明选择性的eNOS抑制可改善急性腹膜炎时腹膜转运参数，预防血管改变。

炎症状态下，同样影响水的转运，有研究表明鼠和人类腹膜末端血管床都特异性地分布着一种水通道蛋白aquaporin1(AQP1)[12]，对生物膜水的通透性起着决定作用。Yang等[13]通过稀释示踪法证实，在缺乏AQP1的小鼠中，渗量驱动的水转运明显减少。Ni等[14]也发现，在相同渗量的梯度作用下，AQP1基因敲除的小鼠和同时出生的其他小鼠相比，对钠的筛滤作用及超滤明显降低(图3)。可见，水通道在PD中发挥着了重要作用。Stoenoiu等[15]进一步研究表明，大剂量注射地塞米松(1～4 mg/kg)5d以上，使大鼠腹膜毛细血管内皮细胞AQP1 mRNA表达增加，同时应用糖皮质激素受体(GR)拮抗剂RU-486可阻断AQP表达的增加，因此，糖皮质激素等药物治疗有望成为改善PD患者超滤下降的一种方式。

图2 eNOS对于腹膜转运及结构的影响[10]

图3 AQP1在腹膜的分布及作用[14]

腹膜退化的病理生理学机制

腹膜纤维化可导致腹膜结构和功能的丧失，是患者退出PD的主要原因之一。此过程受多种因素影响。腹膜间皮细胞在腹膜损伤后发生上皮细胞间质转分化(EMT)[16]，或在生长因子(图4)的作用下形成纤维母细胞，是腹膜纤维化的始动因素[17]，而这一过程和血管生成[18]以及溶质转运的改变[19]密切相关，是血管生成和纤维化相互关联的桥梁。

上皮细胞间质转分化(EMT) 研究表明预防EMT可减轻腹膜纤维化及血管生成，维护腹膜的功能[20]。EMT过程包括：细胞-细胞以及细胞-基质间关联的破坏、细胞极性的消失、细胞骨架的重排、基膜的降解，随后实现细胞的移行或浸润[21]。

图4 腹膜间皮细胞的EMT(×200)[17]

最近的研究还发现了EMT的生物标记，如上皮黏附蛋白(E-cadherin)的缺失，间质标志物纤维母细胞特异蛋白1的上调[22]。E-cadherin的表达受基因表达以及细胞内外蛋白分解等多个环节调节。锌指DNA结合蛋白snail，slug，twist，E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)、ZEB2等调节蛋白可抑制E-cadherin的表达，这些调节蛋白受血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、Wnt蛋白等生长因子调节[23]。Aguilera等[24]通过间皮细胞培养表明，雷帕霉素作为哺乳动物的雷帕霉素受体(mTOR)的抑制剂，可缓解TGF-β对E-cadherin的抑制作用，从而抑制EMT。同样，骨变形蛋白7作为TGF-β的拮抗蛋白，可抑制间皮细胞培养的EMT[21]。

细胞浸润是EMT过程不可少的一步。基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9属于明胶酶类，可特异性降解基膜的IV型胶原，MMPs除了胶原酶的活性，还可降解生长因子前体以及生长因子结合蛋白[25]，改变其他受体及蛋白酶的活性。Cheng等[26]通过肾小管上皮细胞的培养发现，EMT过程中MMP-2特异性地表达，抑制MMP-2可抑制EMT。有研究通过反复注射葡萄糖酸氯己定建立小鼠腹膜纤维化模型，研究了金属蛋白酶抑制物的作用[27]。MMP抑制剂可抑制纤维化及血管生成，但对EMT本身的影响目前尚无研究。

腹膜纤维化和血管生成腹膜纤维化及血管生成导致腹膜增厚是绝大多数PD患者必经的共同改变(图5)[28]。少数患者腹膜纤维化表现为侵袭性的网膜包裹(EPS)，死亡率明显升高。腹膜纤维化和血管生成通常同时发生，减少血管生成可减轻纤维化[29]。

腹膜纤维化的机制尚不完全清楚。人类的尸解和动物研究都表明尿毒症本身可导致腹膜纤维化[28,30]。目前的研究主要关注PD液的生物相容性及其对腹膜的可能影响。标准PD液除了具备低pH值、乳酸缓冲系统外，还需要含有高浓度葡萄糖，经过高温灭菌后含有葡萄糖降解产物(GDPs)。Ha等通过间皮细胞培养观察到，高浓度葡萄糖可刺激促纤维化的生长因子合成[31]。体内、体外的实验均发现GDPs可刺激腹膜纤维化及血管生成。因此，尿毒症加上非生理性的PD液，容易在腹膜组织形成各种糖基化产物(AGEs)。AGE和受体(RAGE)结合诱发纤维化[32]。Schwenger等[33]对RAGE缺失的小鼠进行研究表明，GDPs可同时诱发纤维化和血管生成。

图5 腹膜透析(PD)给腹膜带来的不利改变

纤维母细胞是腹膜纤维化的一个关键调节因素，Okada等[34]以纤维母细胞特异的引物合成腺苷激酶基因，建立纤维母细胞耗竭的转基因小鼠模型，选择性地使纤维母细胞耗竭，减少了纤维化及血管生成。EPS是PD的主要并发症之一，发生率尚不确定，有必要建立理想的EPS动物模型进一步研究。目前的标准模型是通过每日注射葡萄糖酸氯己定的方法建立的。最近Liu等[35]以表达TGF-β1的辅助依赖型腺病毒(HDAdTGF-β1)建立了相似的模型。和第一代腺病毒基因不同，HDAdTGF-β1可延长表达，1次注射就可使腹膜进行性纤维化，形成网膜包裹，抑制体重增长，建立类似EPS的小鼠模型。

小结：除了腹膜毛细血管内皮固有的水通道AQP1对腹膜超滤的影响，腹膜炎的反复发生和PD液的生物不相容是导致腹膜纤维化，决定腹膜功能的主要因素。腹膜感染时，IL-6等细胞因子促进炎症反应，以利于细菌清除，但腹膜炎的反复发生，加上长期浸泡在非生理性PD液环境中，容易出现腹膜损伤，使间皮细胞失去完整性，促使EMT，从而进一步发生纤维化及血管生成(图5)。人们正从各个环节进行探索，为基础研究转化为干预措施，延长腹膜的生存时间提供了重要依据。

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