不同浓度钙离子对人腹膜间皮细胞E-钙黏蛋白、成纤维细胞特异蛋白、波形蛋白表达的影响

彭 翔 刘伏友 孙 林 李 瑛 肖 力 李 军

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是治疗终末期肾功能衰竭的有效方法之一。腹膜纤维化导致的超滤失败不仅严重影响患者的生存与生活，而且是造成大量患者退出PD的重要原因。研究发现，非生物相容性的PD液长期刺激人腹膜间皮细胞(human mesothelial cell，HPMCs)诱导其发生上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腹膜纤维化早期可逆阶段，因此抑制EMT被认为是防治腹膜纤维化病变的理想方法[1]，降低PD液的非生物相容性以减缓腹膜间皮细胞EMT的进程逐渐成为肾脏病专业研究的热点。钙离子是PD液中的主要电解质成分之一，对于维持正常钙磷代谢、防治肾性骨病意义重大。美国National Kidney EFoundation(NKF) K/DOQI 2003关于慢性肾脏病骨代谢及其疾病的临床实践指南建议血液透析(HD)和PD的钙离子浓度应当为1.25 mmol/L，以减少高钙血症及继发性血管和软组织钙化[2]。由于CKD患者骨代谢及其疾病复杂多变，目前应用于临床的PD液钙离子浓度为1.0～1.75 mmol/L，以便个体化治疗。但迄今尚缺乏不同钙浓度对人腹膜间皮细胞EMT的相关研究。E-钙黏蛋白(E-cadherin)、成纤维细胞特异蛋白(FSP1)、波形蛋白(Vimentin)是判断腹膜间皮细胞是否发生EMT的三种标志性蛋白质，本文通过观察不同浓度钙离子对体外培养的HPMCs中E-cadherin、FSP1、Vimentin的影响，试图寻找较为理想钙离子浓度，为防治腹膜纤维化提供新的思路。

材料与方法

主要试剂Chamber slides(美国Corning)、小鼠抗人E-cadherin抗体(美国CST)，小鼠兔抗Vimentin抗体(美国abcam)，抗FSP1抗体(美国Cusabio)、抗β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠和抗兔IgG二抗(北京中杉)、FITC标记二抗和TRICT标记二抗(美国santa cruz)、低糖不含钙DMEM培养液(美国GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青)、CaCl2·2H2O(美国Sigma)、BCA蛋白浓度监测试剂盒和RIPA裂解液(上海碧云天)、ECL显影液(美国Millipore)。

细胞培养与试验分组HPMCs细胞株(HMrSV5)由上海第一医院姚建教授馈赠。HMrSV5生长于含10%胎牛血清、2 mmol/L的L-谷氨酰胺的低糖含钙DMEM培养液中，5%的CO2、37℃孵育培养增生传代；按1×106/孔密度将上述细胞均匀种于六孔培养板和四孔chamber slides中，当细胞融合80%则改用无血清含钙DMEM同步，24h后按实验要求更换为不同钙浓度(0.25、0.75、1.25、1.75、2.25 mmol/L)的无血清DMEM培养液共同孵育48h。同时设不含钙的DMEM组为对照组。每次实验均重复3次。

免疫蛋白印记分析[3]HMrSV5细胞总蛋白的提取采用RIPA裂解液。蛋白含量采用BCA试剂盒以紫外分光度法在562 nm处进行浓度测定。取总蛋白30 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后，转印蛋白质置聚偏氟乙烯(PVDF)膜，丽春红染色观察转印效果，然后用含4%牛血清白蛋白的PBST 4℃封闭2h，洗膜后分别加入小鼠抗人E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶800)、FSP1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)4℃杂交过夜。再用1∶10 000 HRP标记的羊抗小鼠IgG进行二抗杂交。加ECL液于膜上，反应5 min后置于柯达4 000 MM化学发光成像仪中曝光成像，采用图像分析软件进行吸光度分析。每份标本以各自β-actin作为基准，校正检测标本的蛋白相对表达强度。

间接免疫荧光染色按文献[3]方法，Chamber Slides中生长的细胞处理后，以4%多聚甲醛4℃固定20 min后封闭。以含检测抗体(1∶400)的PBS孵育细胞过夜，充分洗涤后，用含荧光FITC或TRICT标记二抗(1∶200)的PBS室温孵育1h。观察前用含DAPI的封片液封片。

统计学方法计量资料数据以均数±标准差表示。多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间比较采用t检验。应用SPSS 13.0软件系统进行统计分析，P<0.05表示有统计学意义。

结 果

不同浓度钙对HMrSV5细胞表达E-cadherin蛋白的影响Western印迹结果显示，对照组(无钙培养液组)HMrSV5细胞48h时基本无E-cadherin表达；不同浓度钙作用于HMrSV5 48h，钙0.75 mmol/L组E-cadherin蛋白表达开始升高并呈剂量依赖性上调，钙1.25 mmol/L组E-cadherin达到顶峰，随后逐渐降低。2.25 mmol/L组仍高于对照组(图1)。

图1 各组HMrSV5细胞E-cadherin蛋白的表达(蛋白免疫印迹)

间接免疫荧光结果也证实，与对照组比较，不同浓度含钙培养液作用于HMrSV5细胞48h，其表达的E-cadherin荧光强度呈浓度依赖性增强，钙1.25 mmol/L组最强，随后逐渐降低(图2)。

不同浓度钙对HMrSV5细胞表达Vimentin蛋白的影响Western印迹结果显示，对照组(无钙培养液组)HMrSV5细胞有低水平Vimentin表达；不同浓度钙作用于HMrSV5 48h，钙1.75 mmol/L组Vimentin表达开始升高并呈剂量依赖性逐渐上调(图3)。

间接免疫荧光结果也证实，不同浓度含钙培养液作用于HMrSV5细胞48h，自钙1.25 mmol/L组始，HMrSV5细胞ESP1荧光强度呈剂量依赖性增强(图4)。与对照组比较，不同浓度含钙培养液作用于HMrSV5细胞48h，钙1.75、2.25 mmol/L组表达的Vimentin荧光强度显著增强(图4)。

图2 各组HMrSV5细胞E-cadherin蛋白的表达(间接免疫荧光染色，×600)

不同浓度钙对HMrSV5细胞表达FSP1蛋白的影响Western印迹结果显示，对照组(无钙培养液组)HMrSV5细胞有极低水平FSP1表达；不同浓度钙作用于HMrSV5 48h，自钙1.75 mmol/L组开始FSP1表达增强并呈剂量依赖性上调(图5)。

讨 论

作为一种终末分化的上皮细胞，腹膜间皮细胞在PD过程中可发生EMT[4]。近来研究显示，腹膜间皮细胞中与EMT相关的几种蛋白表达均受到钙离子调控，如上皮细胞标志物E-cadherin、间充质细胞标志物Vimentin和FSP1[5-7]。Zamoner等[8]发现，钙离子通道开放、上皮细胞内钙浓度升高可导致Vimentin磷酸化。在体外培养的人角化细胞中，E-cadherin是一种钙离子依赖的黏附蛋白，在低钙离子浓度(30 μmol/L)培养液中，细胞呈单层生长且失去黏附功能，钙离子浓度增加(1.0 mmol/L)时，细胞黏附功能恢复[9]。FSP1本身就属于细胞内钙结合蛋白中钙调蛋白-S100-肌钙蛋白超家族[10]，钙离子对它的功能至关重要。鉴于以上研究结果我们设想PD液中钙离子浓度改变可能会影响腹膜间皮细胞的EMT进程。

生理条件下腹膜间皮细胞高表达E-cadherin，但不表达或极少表达FSP1，而Vimentin存在一定量的基础表达。本研究在体外培养条件下证实，在无钙条件下，腹膜间皮细胞几乎没有E-cadherin表达且细胞黏附性显著降低，细胞极易被胰酶消化脱落。钙离子以剂量依赖性方式诱导腹膜间皮细胞表达E-cadherin逐渐增高，在生理钙浓度(1.25 mmol/L)时其达到顶峰。与E-cadherin的钙浓度依赖性相符合[9]。高于生理浓度钙(≥1.25 mmol/L)能抑制E-cadherin表达，使Vimentin和FSP1表达上调，提示高钙可能通过诱导人腹膜间皮细胞发生EMT，进而影响间皮细胞功能，并可能以此参与腹膜纤维化的发生。

图3 各组HMrSV5细胞Vimentin蛋白的表达(蛋白免疫印迹)

细胞内钙离子是信号转导中关键的第二信使，参与介导骨形成、肌肉收缩、激素分泌、细胞凋亡、细胞增生以及凝血等多种基本生理过程。作为一种分化成熟的上皮细胞，腹膜间皮细胞主要是以钙离子通道的方式实现钙离子由细胞外向细胞内的转运，细胞外钙离子浓度改变势必影响细胞内发挥生理功能的游离钙离子浓度。E-cadherin主要与钙紧张素(catenin)和肌动蛋白丝的细胞骨架连接蛋白形成网络，参与完成上皮细胞的稳定性黏附[11]。FSP1主要参与细胞骨架-膜的相互作用、细胞内信号转导、细胞生长和分化等[12]。在钙离子存在时，FSP1二聚化结合P53羧基末端并使之脱离APC泛素化途径，从而提高β-catenin水平，增加细胞的迁移性并诱导血管发生，所以FSP1在促进细胞EMT中的关键作用与钙离子息息相关[13]。而Vimentin除了参与细胞信号转导、细胞生长及凋亡外，主要介导细胞黏附与迁移[14]，它的表达上调是衡量细胞是否发生EMT改变的重要标志。我们观察到，在无钙培养条件下E-cadherin、FSP1、Vimentin表达均为最低； FSP1、Vimentin蛋白表达在钙离子浓度0～0.75 mmol/L区间均没有统计学差异，而E-cadherin表达呈浓度相关性显著增加。在这个低浓度区间内发生的蛋白表达变化我们认为可能并不属于EMT范畴，而是由于钙的缺乏导致这三种蛋白结构性的合成障碍。虽然钙同时参与调节这些蛋白的表达，但E-cadherin对钙的依赖明显比Vimentin和FSP1的表达更强。人体血清中钙离子的正常浓度为0.94～1.26 mmol/L，我们推测，在高钙环境下此三种蛋白质表达所发生的变化可能系腹膜间皮细胞发生EMT改变所致。

图4 各组HMrSV5细胞Vimentin蛋白与FSP1蛋白的表达(间接免疫荧光染色 ×600)

图5 各组HMrSV5细胞FSP1蛋白的表达(蛋白免疫印迹)

本实验结果提示，使用含钙1.25 mmol/L的培养液诱导人腹膜间皮细胞中的E-cadherin表达最高，而Vimentin和FSP1表达显著低于含钙1.75 mmol/L组且与低于钙1.25 mmol/L组比较无统计学差异。这提示钙1.25 mmol/L组的细胞EMT程度最低，理论上使用钙离子浓度为1.25 mmol/L的PD液时，对患者体内腹膜间皮细胞造成的EMT损伤可能最小。

本研究结果证实钙离子浓度的变化能诱导人腹膜间皮细胞E-cadherin、FSP1、Vimentin蛋白表达发生变化，提示钙离子可能是参与调控间皮细胞EMT的一个重要因素。使用含钙1.25 mmol/L的PD液不但可以纠正钙磷代谢失衡、防治异位钙化，而且对腹膜间皮细胞EMT有一定的防治作用。

本研究结果均来自体外实验，仍需进一步在体内研究中加以验证，且钙离子诱导人腹膜间皮细胞EMT标志蛋白表达变化过程中所涉及的分子机制及其干预研究，也是我们日后研究的方向。本研究有助于认识腹膜间皮细胞EMT的发病机制，也为进一步探讨降低PD液生物不相容性、防止腹膜纤维化提供了实验依据。

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