肌肉萎缩蛋白Fbox-1基因沉默对糖皮质激素作用下肌管萎缩的影响

王会玲 许 烨 张金元

终末期肾功能衰竭(ESRF)和透析患者常并发进行性蛋白质-能量消耗(protein-energy wasting，PEW)，其中骨骼肌消耗(muscle wasting)是导致肾功能衰竭患者虚弱、乏力、生活质量下降的主要原因，也是患者蛋白质-能量性营养不良的主要机制[1]。影响肌肉蛋白质代谢的机制尚不清楚，尿毒症时毒素蓄积、代谢性酸中毒、胰岛素抵抗、微炎症状态等，都可能促进/加速骨骼肌蛋白质分解代谢[2]。文献报道泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)是蛋白质分解的重要执行者，代谢状态下内源性糖皮质激素(glucocorticoids，GC)水平升高，可竞争性拮抗胰岛素受体信号，刺激肌萎缩关键基因表达[3]。我们既往研究显示小鼠慢性肾脏病(CKD)模型的血清GC水平可显著升高10～13倍[4]。本研究通过体外培养肌细胞，研究GC对肌管蛋白质代谢影响及肌肉萎缩蛋白Fbox-1(muscle atrophy F-box,MAFbx,也称为Atrogin-1)的作用机制。

材料和方法

材料与试剂小鼠肌纤维细胞株 C2C12细胞(ATCC A)(晶天生物科技公司)；绿色荧光蛋白病毒载体(SMARTvector Empty vector，Dharmacon)；DMEM培养液(Cellgrov)；胎牛血清(GIBCO)，马血清(Sigma)；液闪计数器(Beckman)；CellLyticTMMT细胞裂解液(Sigma)；RNA提取试剂TRIzol Reagent(invitrogen)；siRNA-Atrogin-1试剂盒(Dharmacon，ON-Target plus SMARTpool，mouse FBx032，Cat#L-049180-00)；Fbx一抗(Everest)；地塞米松(dexmethasone，DEX；American Regent Lab Inc)；荧光倒置显微镜(Olympus 1x70)。

C2C12体外培养及肌管形态观察C2C12细胞以1×106cell/cm2密度接种于6孔板，用含10%胎牛血清的DMEM，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，细胞达90%密度时，换含2%的马血清DMEM继续培养，3～4d后细胞融合分化形成肌管，加入GFP 2 μl/孔，24h后荧光倒置显微镜观察肌管已着色，用DEX处理细胞，48h后观察肌管形态并拍照，用ImageJ软件(NIH，Frederick，MD)分析。

3H-酪氨酸同位素标记检测肌管蛋白合成和分解蛋白合成采用3H-酪氨酸(3H-Tyrosine)掺入法检测，在细胞分化形成肌管后第2～3d，每孔加入2.5 μmol/L3H-Tyrosine×30 min，药物处理2h后，DMEM洗3次×10 min，刮下细胞，以10%三氯乙酸(TCA)沉淀，用0.5N纯碱溶解沉淀，进行液闪计数并测定蛋白浓度，结果以cpm/g表示。蛋白分解采用3H-Tyrosine释放率检测，肌管分化好后，加入3H-Tyrosine×20h，用含2%马血清的DMEM洗3遍以除去培养液中的3H-Tyrosine，加入含2 mmol/L Tyrosine的DMEM，2h后加入药物处理细胞，提取300 μl培养液加入TCA 33.3 μl使终浓度为10%，以后每4h取300 μl培养液并加入TCA，最后一次取样后将细胞刮下移入Ep管，离心，沉淀用0.5N纯碱溶解，所有样本取200 μl进行液闪计数。蛋白降解率计算：各时间点cpm值/cpm总和×100%，绘制曲线。

Western blot分析Atrogin-1表达水平CellLyticTMMT细胞裂解液提取总蛋白，考马斯亮蓝检测蛋白浓度，10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，加入抗-Atrogin-1(Fbx 一抗)；4℃过夜，加入荧光二抗抗山羊或兔IgG(donkey anti-goat/Rabbit IgG)(Invitrogin，Alexa Fluor 680/800)，Odyssey激光成像系统(LiCor)扫描，蛋白表达量用内参照GAPDH校正。

Nothern Blot分析Atrogin-1基因沉默采用小分子干扰DNA片段(siRNA)核糖核酸干扰技术，观察DEX作用下C2C12肌管形态及Atrogin-1表达。方法如下：Mafbx-32 siRNA 6 μl 用100 μl siRNA Transfection Media(Invitrogen)稀释，转染肌管24h后，加入DEX 5 μmol/L，继续培养24h，用TRIzol Reagent(invitrogen)提取总RNA，Northern blot检测肌管中Atrogin-1mRNA表达水平。RT-PCR扩增引物制备探针，引物序列Atrogin-1：(forward)5′-GCA AAC ACT GCC ACA TTC TCTC-3′；(reverse)5′-CTT GAG GGG AAA GTG AGA CG-3′；GAPDH(glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase)探针购自Ambion。采用随机引物标记试剂盒(Amersham)、α-32P dCTP-标记cDNA 探针，膜置于42℃杂交16h，分别以2×、0.2×SSC/0.1%SDS、去离子水洗膜。薄膜置于暗盒中，压上X光片，置-70℃放射自显影24h。mRNA相对表达量用GAPDH校正。

结 果

地塞米松可引起体外培养肌管萎缩体外培养肌细胞融合形成肌管后，加入绿色荧光蛋白可使肌纤维着色，紫外线下呈绿色，肌管粗壮呈条索状，内见融合的细胞核呈点状强烈荧光，GFP不引起肌纤维性状改变。DEX 0.5 μmol/L作用24h后肌管形态无明显改变，1 μmol/L已引起肌管变细，5 μmol/L则肌纤维明显变细，排列稀疏。DEX 5 μmol/L作用24h后，测量肌纤维直径较正常对照组明显下降[(9.69±2.86)μm DEXvs(18.3±3.57)μm GFP，P<0.01)]，提示DEX可引起体外培养肌管萎缩，随DEX剂量增加，肌管逐渐变细(图1 A、B)。

图1 A：培养的C2C12肌细胞经分化后形成肌管，荧光显微镜观察肌管呈条索状，GFP使其着色呈绿色荧光，内见融合的细胞核呈点状强烈荧光；地塞米松(DEX 0～5 μmol/L)作用24h后，DEX > 1 μmol/L可引起肌管萎缩，形态表现为肌纤维变细，排列稀疏(×400)； B：DEX(0～5 μmol/L)作用24h后，测量肌管直径逐渐变细； C：DEX 5 μmol/L作用(0～24h)可促进蛋白分解增加，24h时3H-Tyrosine释放率较对照组升高24.7%； D：DEX 5 μmol/L作用24h后蛋白质合成(3H-Tyrosine掺入率)较对照组下降17.4%； E：Western blot显示DEX剂量依赖性地引起Atrogin-1蛋白表达水平升高

地塞米松促使肌管分解代谢和Atroign-1表达升高给予DEX 5 μmol/L作用0～24h，各时间点3H-Tyrosine释放率逐渐增加，16h后与对照值(CTL)比较有统计学意义(表1)；24h时3H-Tyrosine释放率升高24.7%；同时间点肌管3H-Tyrosine掺入水平较CTL明显降低[(39.22±6.22)cpm/g DEXvs(47.53±4.32)cpm/g CTL；P=0.047)，掺入率下降17.4%。提示DEX可引起蛋白质合成代谢轻度下降，显著促进肌肉蛋白质分解(图1 C、D)。DEX 0～5 μmol/L作用24h，检测Atrogin-1蛋白表达水平升高，以DEX 5 μmol/L作用最显著(图1E)。

表1 地塞米松5 μmol/L作用后各时间点肌管3H-Tyrosine释放率(%)

Atrogin-1基因沉默可改善DEX引起的肌管萎缩应用siRNA技术使Atrogin-1基因沉默，肌管再经DEX 5 μmol/L处理24h后，Northern blot结果提示siRNA可使Atrogin-1 mRNA表达水平显著下降；siRNA对照组Atrogin-1 mRNA表达水平升高约3倍，siRNA-Atrogin-1组仅升高约10%；同时Western blot 结果提示Atrogin-1蛋白表达也显著下降(图2A)。Atrogin-1基因沉默后，再经 DEX 5 μmol/L处理24h，镜下观察肌管形态未见明显改变，SiRNA-Atrogin-1组的肌管直径为[(15.81±3.37)μm DEX)vs(18.63±3.48)μm CTL]，而siRNA-CTL组则出现明显肌管萎缩[(8.64±2.41)μm DEXvs(17.36±3.85)μm CTL，P<0.01)]。上述结果提示Atrogin-1基因沉默对DEX引起的肌萎缩具有保护作用。

图2 A：Northern blot 显示DEX 5 μmol/L作用24h后，siRNA-对照组的Atrogin-1 mRNA水平升高约3倍，siRNA-Atrogin-1组的Atrogin-1 mRNA 水平较对照组仅升高约10%； Western blot显示靶基因沉默后Atrogin-1蛋白表达水平明显下降；B：光镜下观察肌管形态变化，Atrogin-1基因沉默，再次给予DEX 5 μmol/L作用24h后，未见肌管明显萎缩(×200)

讨 论

近年来研究发现病理条件下内源性GC水平升高可能是促进蛋白质分解的重要因素[5]。May等[6]以NH4Cl造成的代谢性酸中毒大鼠为模型，发现24h尿液中皮质酮水平升高12倍以上；我们既往研究提示尿毒症小鼠模型其内源性GC水平较正常对照组升高13倍以上。本研究采用体外培养骨骼肌细胞，并使之分化为具有肌肉特性的肌管，给予外源性DEX后可以显著刺激肌管萎缩，并影响蛋白质代谢，使肌肉蛋白质合成下降，明显促进蛋白质分解代谢。这表明高水平的GC可降低肌肉蛋白合成，加速蛋白分解。

体内蛋白质分解主要通过3种途径，溶酶体-蛋白酶途径、钙依赖-蛋白酶途径和ATP-泛素-蛋白酶途径，目前确定后者是体内蛋白分解的主要途径。病理状态下肌肉特异性的E3连接酶——Atrogin-1被激活，并通过蛋白酶体直接将骨骼肌蛋白质分解为多肽或氨基酸片段，编码Atrogin-1的基因可能是控制肌肉蛋白分解的关键基因[7]。Mitch等[8]发现切除动物肾上腺或给予GC受体阻滞剂后，可以抑制酸中毒、胰岛素缺乏、饥饿或脓毒血症状态下的肌肉萎缩，若再次给予高于生理剂量的GC后，又可出现UPS激活并引起肌肉萎缩。本研究明确DEX可以剂量依赖性地刺激Atrogin-1蛋白表达，提示GC可直接升高Atrogin-1而引起肌肉萎缩。我们最近对GC引起肌萎缩的机制的研究，揭示GC通过其受体(glucocorticoid receptor，GR)直接干预胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)相关的 PI3K/Akt活性，促进Atrogin-1 mRNA表达，使PI3K/Akt活性下降，引起肌肉萎缩；肌肉特异性GR敲除的转基因小鼠(muscle glucocorticoid receptor knock-out，MGRKO)，可抵抗糖尿病引起的Atrogin-1 mRNA表达；我们还发现生理剂量的GC可加剧胰岛素受体敲除小鼠的肌肉蛋白分解，GR激活后可竞争PI3K，这一非基因性的竞争作用损害胰岛素信号，使蛋白分解增加。

目前对骨骼肌消耗性营养不良尚无有效治疗方法，以基因为靶点进行干预是目前最前沿的研究方向。Atrogin-1基因是否专一性地控制骨骼肌萎缩？我们采用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)予以明确。RNAi是一种高效的基因表达阻断技术，它通过体外合成或体内表达含21～23个核苷酸的双链siRNA，对特定基因进行功能封闭或降低表达，以确定靶基因的功能，siRNA 技术也称基因沉默技术(gene silence)。由于 siRNA 具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失，它比反义 RNA 技术和同源共抑制法更有效，因此 siRNA 可以作为一种强有力的研究工具[10]。我们对Atrogin-1基因沉默后，再次给予DEX则不引起的肌管萎缩，提示以Atrogin-1基因为治疗靶点，抑制Atrogin-1的表达，对GC作用下的肌萎缩具有保护作用。

综上所述，本研究明确GC通过激活Atrogin-1，引起肌肉细胞蛋白质分解代谢增加，并抑制蛋白合成代谢，从而导致肌肉萎缩；Atrogin-1基因沉默可改善GC引起的肌肉萎缩，Atrogin-1基因可能是逆转肌肉消耗性营养不良的有效靶点。

特别感谢美国Baylor医学院肾脏病实验室胡兆勇博士的指导和帮助！

1 Fouque D,Kalantar-Zadeh K,Kopple J,et al.A proposed nomenclature and diagnostic criteria for protein-energy wasting in acute and chronic kidney disease.Kidney Int,2008,73(4):391-398.

2 Du J,Hu Z,Mitch WE.Molecular mechanisms activating muscle protein degradation in chronic kidney disease and other catabolic conditions.Eur J Clin Invest,2005,35(3):157-163.

3 Waddell DS,Baehr LM,van den Brandt J,et al.The glucocorticoid receptor and FOXO1 synergistically activate the skeletal muscle atrophy-associated MuRF1 gene.Am J Physiol Endocrinol Metab,2008,295(4):E785-E797.

4 王会玲,桂志红,许 烨,等.CKD时高糖皮质激素通过激活 Atrogin-1、MuRF-1引起骨骼肌萎缩.中国中西医结合肾病杂志,2010,11:951-956.

5 Lang CH,Huber D,Frost RA.Burn-induced increase in atrogin-1 and MuRF-1 in skeletal muscle is glucocorticoid independent but downregulated by IGF-I.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2007,292(1):R328-R336.

6 May RC,Kelly RA,Mitch WE.Metabolic acidosis stimulates protein degradation in rat muscle by a glucocorticoid-dependent mechanism.J Clin Invest,1986,77(2):614-621.

7 Lecker SH,Jagoe RT,Gilbert A,et al.Multiple types of skeletal muscle atrophy involve a common program of changes in gene expression.FASEB J,2004,18(1):39-51.

8 Mitch WE,Bailey JL,Wang X,et al.Evaluation of signals activating ubiquitin-proteasome proteolysis in a model of muscle wasting.Am J Physiol,1999,276(5 Pt 1):C1132-C1138.

9 Hu Z,Wang H,Lee IH,et al.Endogenous glucocorticoids and impaired insulin signaling are both required to stimulate muscle wasting under pathophysiological conditions in mice.J Clin Invest,2009,119(10):3059-3069.

10 Lagirand-Cantaloube J,Cornille K,Csibi A,et al.Inhibition of atrogin-1/MAFbx mediated MyoD proteolysis prevents skeletal muscle atrophy in vivo.PLoS One,2009,4(3):e4973.