不同产地通关藤中总皂苷的含量测定

张镓小 张 慧 倪 冲 李春雪 康廷国

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

中药通关藤为萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima(Roxb．)Wight et Arn的干燥藤茎，又名通光散、乌骨藤等，主产于云南。始载于《滇南本草》［1］，具现代药理证实具有平喘、降压、抗菌、调节免疫功能、抗肿瘤等作用。目前临床上作为治疗肿瘤药物用于胃癌、肝癌、宫颈癌等治疗。通关藤主含C21甾体皂苷类 (主要是C21甾体的糖苷)和多糖，还含有少量生物碱及树脂等 ，其中C21甾体皂苷类成分是通光藤抗炎、抗肿瘤及抗生育活性的物质基础［2，3］。

本课题组前期经分离得到通关藤苷D等C21甾体皂苷类成分［4］，并经体外实验证实通关藤苷D具有抗肿瘤活性。现采用通关藤苷D为对照品，采用比色法测定通关藤中总皂苷的含量，同时比较了不同产地通关藤中总皂苷的含量，为通关藤药材的质量控制提供了可靠的分析方法和依据。以通关藤苷D为对照测定总皂苷含量，尚未见文献报道。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV－3010紫外可见分光光度计 (日本日立司);YB－IA真空干燥箱 (天津市鑫洲科技有限公司);HH－S型恒温水浴锅 (巩义市予华仪器有限公司);RE－52C旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 材料 通关藤苷D(105℃干燥至恒重)，辽宁中医药大学新药研发基地提供，纯度98.2%;通关藤购于安国市杏林药材有限公司，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn的干燥藤茎。石油醚、氯仿、甲醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸、乙醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 精密称取药材粉末120mg，置50mL锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声30min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失重量，滤过，即得。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取通关藤苷D 8mg，置50mL锥形瓶中，精密加入加甲醇50mL使溶解，制成浓度为0.16mg/mL的对照品溶液。

2.3 阴性空白对照溶液的制备 不加药材，照“2.1”项下方法制备阴性溶液。

2.4 样品的测定 精密量取供试品和标准品溶液各0.5mL，分别置于10mL具塞试管中，于60℃水浴上挥干甲醇，加入香草醛－冰醋酸溶液0.4mL和高氯酸0.6mL，摇匀，70℃水浴加热15min，取出后立即用流水冷却，加入10mL冰醋酸稀释，以不加样品溶液的平行样为空白。照紫外－可见分光光度法(《中国药典》2010版一部附录V A)在462nm处测定吸收度，同法测定对照品的吸收度，计算含量即得。

2.5 最佳测定条件的确定

2.5.1 测定波长的选择 照“2.4”项下方法操作，以不加样品溶液的平行样为空白。在紫外－可见分光光度计上以400～700nm范围进行扫描，确定最大吸收波长。结果显示标准品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为462nm，为此确定检测波长为462nm，见图1～2。

2.5.2 阴性干扰试验 按“2.5.1”项下方法测定阴性液，结果显示，阴性液不显色，在462nm处无吸收，证明阴性液无干扰。

2.5.3 香草醛溶液浓度的确定 分别配制1%、3%、5%、7%、9%的香草醛－冰醋酸溶液，按“2.4”项下方法为以香草醛－高氯酸法显色后，在462nm处测定。各浓度条件下供试品显色后吸收度分别为 0.334、0.418、0.524、0.531、0.519。结果显示，当香草醛－冰醋酸溶液的浓度低于5%时，样品吸收度随香草醛－冰醋酸溶液浓度的增大而增大;当浓度增加至5%时，样品吸收度趋于稳定。因此，最终确定香草醛－冰醋酸溶液浓度为5%。

2.5.4 高氯酸用量的选择 按“2.4”项下方法操作，高氯酸加入量分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，测定吸收度分别为 0.402、0.537、0.541、0.535、0.529。结果显示，当高氯酸用量为0.6mL时，吸收度较高，大于0.6mL时样品吸收度值不在增加，因此高氯酸的用量确定为0.6mL。

2.6 方法学的考察

2.6.1 线性范围试验 精密吸取通关藤苷D对照品溶液(浓度0.1608mg/mL)0.10、0.25、0.50、0.75、1.0mL 置于10mL具塞试管中，照“2.4”项下方法进行操作，在462nm波长处测定吸收度，以3次测定的吸收度的平均值作为纵坐标，以对照品含量为横坐标，绘制标准曲线。结果回归方程为Y=0.013X －0.009，r=0.9993，本品在16.080μg～160.8μg范围内，呈良好的线性关系。

2.6.2 精密度试验 分别由三个不同的实验人员，分别在不同日期，按“2.1”项下方法制备6份供试品溶液，并按“2.4”项下方法操作。结果显示，RSD为1.46%，小于2.0%，精密度符合规定。

2.6.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.4”项下方法操作，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0h时间间隔内，在462nm测定，吸收度RSD为1.71%。说明供试品溶液显色后在2.0小时内待测组分化学性质稳定。

2.6.4 重复性试验 精密称取样品6份，按照“2.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下方法进行操作，在462nm测定吸收度。含量均值为636.9mg/g，RSD为0.87%(n=6)，表明本试验测定方法的重复性良好。

2.6.5 回收率试验 精密称取已知含量的云南产通关藤药材6份各60mg，置锥形瓶中，精密加入对照品溶液5mL(0.8217 mg/mL)，按照“2.4”项下方法操作，测定吸收度。结果显示，本方法总皂苷的回收率在96.87%～102.37%之间，符合有关规定，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.6.6 样品含量的测定

精密称取云南、四川、广西、成都四个不同产地的药材60mg，按“2.1”及“2.4”项下方法操作，照紫外－可见分光光度法(《中国药国》2010版一部附录VA)在462nm处测定吸收度，计算总皂苷的含量，结果见表2。测定结果显示，不同产地通关藤总皂苷的含量有一定差异性，其中云南产药材的总皂苷含量为最高，这与云南昆明通关藤为地道药材相一致，此结果将对临床用药提供参考。

表2 总皂苷含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 比色法测定植物中甾体化合物具有显色灵敏度高、重复性好，且操作简便、快速等优点，因此在甾体类成分测定中占有较为重要的地位。本实验采用了香草醛－高氯酸法，该方法专属性强、操作更为简便。在少量样品的测定时性质还是比较稳定的。重复性、回收率等方法学考察均符合有关规定，可以用于通关藤总皂苷的含量测定。

3.2 不同产地通关藤中总皂苷含量有一定差异性，其中产地云南的含量为最高，这与云南昆明为地道药材相一致，此结果将对临床用药提供参考。

［1］邢旺兴，陈斌，宓鹤鸣，等．乌骨藤辨考［J］．中药材，2003，26(7):524－526．

［2］全国中草药汇编编写组．全国中草药汇编［M］．第二版．北京:人民卫生出版社，1996．

［3］陈纪军，张壮鑫，张润珍，等．裂冠牛奶菜的化学成分［J］．云南植物研究 ，1990，12(1):93．

［4］张慧，翟延君，初正云，等．乌骨藤中五环三萜类化合物的分离鉴定［J］．分析化学，2007，35(9):1377－1380．