山茱萸提取物对人肺癌A549细胞凋亡作用的实验研究

王恩军 季文琦 靳 祎 柴广军 王 哲 王 静

1．河北大学，河北 保定 071000;2．河北省保定市高阳县医院，河北 高阳 0715000;3．河北省保定市第二医院，河北 保定 071000;4．河北省保定市一中分校，河北 保定 071000

山茱萸中含有挥发油、糖类、有机酸类、酯类等多种化学成分，具有良好的应用价值和开发前景［1］。本试验采用人肺癌A549细胞作为试验模型，研究山茱萸水、醇提取物体外抗肺癌活性，为研发山茱萸的抗癌活性成分提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 ①山茱萸:原生药从河北安国县药材公司购买;②人肺癌A549细胞:由河北农业大学生命科学院提供。

1.2 实验方法

1.2.1 山茱萸提取物的制备

1.2.1.1 醇提取物的制备 称取山茱萸样品500g，按1:6的比例 (W/V)加入3000mL75%(v/v)乙醇浸泡过夜，回流提取两次，每次2h。合并两次提取液抽滤，弃去滤渣，滤液旋转蒸发浓缩后，加入5倍量的蒸馏水沉淀除去水不溶性杂质，抽滤，滤液冷冻干燥得到山茱萸醇提取物，实验前用生理盐水稀释成合适浓度，滤器除菌，4℃冰箱保存备用。

1.2.1.2 水提取物的制备 称取山茱萸样品500g，加蒸馏水3000 mL浸泡过夜，100℃水浴1 h，抽滤除去不溶物质，真空减压蒸馏至少量，冷冻干燥得山茱萸水提取物，实验前用生理盐水稀释成合适浓度，滤器除菌，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 MTT法检测山茱萸提取物对A549细胞增殖的影响试验方法见文献［2］，试验分三组:阴性对照组加入生理盐水，阳性对照组加入顺铂 (20μg/mL)，实验组加入不同浓度的山茱萸水、醇提取物，计算细胞增殖的抑制率及半数抑制率 (IC50)。

1.2.3 形态学观察 取5×104个/mL的A549细胞接种于48孔培养板内，培养24 h，实验组加入80 mg/mL的山茱萸水、醇提取物，对照组加入生理盐水，培养48 h后在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

2 结果

2.1 山茱萸提取物对A549细胞增殖的影响

2.1.1 A549细胞经不同浓度的山茱萸水、醇提取物作用48 h后，显示出不同的抑制作用，同一浓度的水提取物抑制作用强于醇提取物，并且在一定范围内抑制作用与浓度成正相关 (P＜0.05)(表1)。

2.1.2 山茱萸提取物对A549细胞的IC50(48 h)［3］通过A549细胞的生长曲线可以得出水提取物的IC50约为57 mg/mL，醇提取物的IC50约为214 mg/mL，由此可见水提取物抑制A549细胞生长的作用更强，敏感性更好。

2.2 形态学观察 对照组A549细胞为长梭形或多角形，排列不规则，细胞边缘清晰，隐约可见胞核圆形，位于中央;A549细胞经山茱萸水、醇提取物处理后，细胞数量减少，逐渐变为圆形，体积缩小，细胞间隙增大，培养液中可见许多漂浮碎片，水提取物作用的A549细胞密度更为稀疏。

表1 不同浓度的山茱萸提取物对A549细胞增殖的抑制作用

3 讨论

近年来研究发现山茱萸具有免疫调节、降低血糖、抗血小板聚集、抗菌等多种药理活性［4］，在抗癌方面山茱萸对肿瘤细胞有明显的抑制作用［5－7］。本文使用人肺腺癌A549细胞作为受试细胞株，采用MTT法比较不同浓度的山茱萸水提取物和醇提取物对细胞的抑制作用。结果表明:不同浓度的山茱萸提取物对A549细胞都有一定程度的抑制作用，同一浓度下，山茱萸水提取物的抑制作用更明显;形态学观察显示山茱萸水、醇提取物作用于细胞后均可见到较为典型的细胞凋亡变化。

［1］张聪，金德庄．山茱萸的研究进展［J］．上海医药，2008，29(10):464－467．

［2］司徒镇强，吴军正．细胞培养［M］．西安:世界图书出版公司，2004，25－43，44－57，84－89，251－291．

［3］赵斌，葛金芳，朱娟娟等．小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法［J］．安徽医药，2007，11(9):834．

［4］中药诱导肿瘤细胞凋亡研究进展［J］．中国中西医结合外科杂志，2004，10(4):331－333．

［5］张兰桐，袁志芳，杜英峰等．山茱萸的研究近况及开发前景［J］．中草药，2004，35(8):952－955．

［6］刘洪，许惠琴．山茱萸及其主要成分的药理学研究进展［J］．南京中医药大学学报，2003，19(4):254－256．

［7］季宇彬主编．中药多糖的化学与药理［M］．北京:人民卫生出版社，2005，226－230．