使用TEV-LIC克隆与表达系统对蛋白激发子PebC1的纯化

刘权

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

PebC1是一种来自与灰葡萄孢菌的蛋白激发子，Genbank登陆号为FJ748868。前期研究表明，该蛋白具有提高植物综合抗逆性的功能[1]。由于其作用机理尚未阐明，因此进一步的结构和功能研究有待进行。而初步的研究发现，该蛋白由于自身性质原因，如结合杂蛋白、自身形成二聚体等，难于通过纯化得到高纯度和高通量的蛋白，阻碍了对该蛋白功能的深入研究。

传统的克隆与表达体系以表达载体的多克隆位点区为基础，使用双酶切制造粘性末端并使用T4 DNA连接酶进行连接[2-3]。而TEV-LIC克隆和表达系统是本实验室依照文献报道[4]进行改造的载体，基于pET30a原核表达载体，加入了LIC技术（Ligation Independent Clone，不依赖连接反应的克隆）和TEV（Tobacco Etch Virus，烟草蚀纹病毒）蛋白酶切割位点，以及两个供纯化的亲和标签：His（Histidine，组氨酸）和 MBP（Maltose Binding Protein，麦芽糖结合蛋白）[5-6]。在克隆时，利用T4 DNA聚合酶的外切活性制造的互补粘性末端进行自然搭接，不需要限制性内切酶进行双酶切；在表达时，MBP标签可提高蛋白的表达效率和可溶性；在纯化时，利用His和MBP标签进行双重纯化，随后根据需要用TEV蛋白酶切掉标签，得到高纯度且无多余氨基酸序列的目的蛋白（图 1）。

图1 TEV-LIC pET30a克隆载体示意图Fig.1 The Schematic illustration of pET30a TEV-LIC vector

在克隆时，LIC系统利用T4 DNA聚合酶的3’-5’的外切活性，将设计好的载体和引物切成互补的粘性末端（图2），然后使载体和引物自然搭接，转化大肠杆菌后利用大肠杆菌的复制系统得到连接好的表达载体质粒。这样的连接手段不需要使用限制性内切酶进行双酶切和T4 DNA连接酶进行连接。

图2 LIC体系的载体和PCR产物的处理过程Fig.2 The treatment process of vector and PCR products in LIC system

将PebC1通过TEV-LIC克隆与表达系统进行表达、纯化、切去标签，得到了高纯度的PebC1。这为PebC1的功能深入研究打下了基础，也提供了蛋白纯化的新思路。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

改造后的pET30a（TEV-LIC）质粒、pET28apebC1表达质粒为本实验室保存；TEV酶为本实验室纯化保存；DH5α、BL21（DE3）感受态细胞购自北京天根生化公司。

1.2 试剂与仪器

Ssp I内切酶、T4 DNA聚合酶、Taq酶、PCR相关试剂均购自大连宝生物公司；PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自北京天根生化公司；Ni NTA Resin、Amylose Resin、Hitrap Q 5 mL 阴离子交换柱、Superdex20016/60分子筛购自 GE公司；AKTA Purifier蛋白纯化仪购自GE公司。

1.3 pebC1克隆到表达载体

pET30a（TEV-LIC）载体质粒使用Ssp I于37℃消化处理50 min。酶切产物使用胶回收试剂盒进行回收。使用T4 DNA聚合酶在加入dGTP的体系中处理，经胶回收后，-20℃保存备用。

根据pebC1的基因序列和pET30a（TEV-LIC）的载体序列设计引物，上游引物为（TACTTCCAATCCA ATGCCATGTCGAACCCACGT），下游引物为（TTATC CACTTCCAATGCTACTATATGCTTAGAG）。以 pET28a-pebC1表达质粒为模板扩增pebC1基因。PCR反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃∝。产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，使用T4 DNA聚合酶在加入dCTP的体系中处理，经胶回收后，于-20℃保存。将处理后的TEV-LIC载体质粒和pebC1基因按照 1∶2（μL）的比例混合，于 22 ℃反应 5 min，利用粘性末端进行自然搭接，加入1 μL 25 mM的EDTA终止反应。连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，测序正确后提取质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，得到pET30 a-pebC1（TEV-LIC）表达菌株。

1.4 PebC1的表达与纯化

挑取PebC1表达菌的单克隆至100 mL LB液体培养基的三角瓶中于37℃、200 r·min-1培养过夜。1∶100接至含1000 mL培养基的2 L三角瓶内，继续培养至OD600为0.8时加入终浓度0.4 mM的IPTG诱导6 h。5000 r·min-1离心收集菌体，使用Binding Buffer（50 mM Tris，500 mM NaCl，5 mM咪唑，pH8.0）悬浮菌体，超声破碎后12000 r·min-1离心，收集上清为蛋白粗提液。

将蛋白粗提液通过Ni-NTA Resin进行His标签的亲和纯化，上样后用Binding Buffer充分平衡柱床，用Wash Buffer（50 mM Tris，500 mM NaCl，20 mM咪唑，pH8.0）除去非特异结合的杂蛋白，最后用Elution Buffer（50 mM Tris，500 mM NaCl，150 mM 咪 唑，pH8.0）洗脱得到目的蛋白。

将收集的蛋白用超滤管替换缓冲液为MBP Binding Buffer（50 mM Tris，200 mM NaCl，pH8.0），用Amylose Resin利用MBP标签进行亲和纯化，上样后用MBP Binding Buffer充分平衡，用MBP Wash Buffer（50 mM Tris，200 mM NaCl，2 mM Maltose，pH 8.0）除去杂蛋白，最后用 MBP Elution Buffer（50 mM Tris，200 mM NaCl，10 mM Maltose，pH8.0） 洗脱得到目的蛋白。

将收集的蛋白浓缩至约10 mg·mL-1，每mg蛋白加入10 μg的TEV蛋白酶，4℃反应过夜，切掉标签。切掉标签后的蛋白混合液用超滤管替换缓冲液为低盐 Buffer（50 mM Tris，50 mM NaCl，pH8.0）。使用Hitrap Q阴离子交换柱分离标签（His和MBP部分）和目的蛋白，NaCl浓度由50-500 mM的线性梯度进行洗脱。根据吸收峰收集目的蛋白。将目的蛋白浓缩至10 mg·mL-1，用Superdex 200分子筛进行最后的纯化。SDS-PAGE电泳检测纯化所得的蛋白。

2 结果与分析

2.1 pebC1克隆到表达载体

TEV-LIC载体使用Ssp I进行平末端切割，随后使用T4 DNA聚合酶在dGTP存在的情况下进行3’-5’的外切，遇到序列中的GTP碱基时终止反应，得到粘性末端；pebC1基因经过PCR扩增，使用T4 DNA聚合酶在dCTP存在的情况下进行3’-5’的外切，遇到序列中的CTP碱基时终止反应，得到与载体相互补的粘性末端（dCTP、dGTP的作用是降低碱基序列中的CTP、GTP被T4 DNA聚合酶结合作用的概率，从而达到终止外切反应的目的）。

经过自然搭接，载体与目的基因的粘性末端通过两条链间的碱基互补配对相连接，但是每条链内部的接头处的碱基间磷酸二酯键并未形成（T4 DNA连接酶才能够催化磷酸二酯键的形成）。在转化到感受态细胞后，细菌在质粒扩增的过程中会自然完成磷酸二酯键的连接。

质粒载体转化感受态细胞后挑取阳性克隆经过PCR检测，电泳检测发现载体内包含目的基因（图3）。经测序确认目的基因正确连接入载体。

2.2 PebC1的纯化

PebC1表达菌经过IPTG诱导，通过离心收集菌体，超生破碎细胞释放目的蛋白。蛋白粗提液经过His和MBP标签纯化得到初步纯化的蛋白；随后使用TEV蛋白酶切割将目的蛋白与标签部分切开；再通过离子交换层析和分子筛将两者分开；从而得到高纯度且不带有多余氨基酸序列的PebC1蛋白。（图4）

图3 pebC1插入到表达载体的PCR检测Fig.3 The PCR detection for pebC1 inserted to expression vector

图4 PebC1蛋白的纯化Fig.4 The purification of PebC1

3 讨论

研究了如何使用TEV-LIC体系将PebC1进行表达纯化，并得到了高纯度的目的蛋白。虽然目前PebC1的生理功能研究表明其具有提高植物综合抗性的功能，但是其内在的分子机理并不清楚，这需要在分子水平，尤其是蛋白质结构与功能、蛋白质相互作用等方面进行深入研究。这些研究都需要有大量、高纯度的目的蛋白作为研究材料，而本实验则解决了这个问题，为PebC1的深入分子机理研究打下了基础。

TEV-LIC克隆与表达体系与传统的体系相比，具有以下优点：（1）不需要进行双酶切处理，避免了双酶切过程中容易出现的星号活性问题；（2）在设计引物时不需要考虑基因内部是否有双酶切的限制性内切酶切割位点，适用性广；（3）连接依靠碱基配对，省去了T4 DNA连接酶进行连接的步骤，节省经费；（4）具有双重纯化标签， 且能够通过蛋白酶切去，方便纯化，且最终得到不附加多余氨基酸序列的目的蛋白。因此，TEV-LIC克隆与表达体系值得在蛋白表达与纯化研究中推广使用。

［1］Zhang Y，Yang X，Liu Q，et al.Purification of novel protein elicitor from Botrytis cinerea that induces disease resistance and drought tolerance in plants［J］.Microbiol Res，2010,165（2）:142-51.

［2］Stols L，Gu M，Dieckman L，et al.A new vector for highthroughput，ligation-independent cloning encoding a tobacco etch virus protease cleavage site［J］.Protein Expr Purif，2002,25（1）:8-15.

［3］张晶，朱洪伟，崔玉东.金黄色葡萄球菌GapC基因的克隆和表达［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2008，20（3）:50-53.

［4］倪雪，宋佰芬，李迎春，等.牛白细胞介素-18基因原核表达载体的构建［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2009，21（6）:51-53.

［5］Gileadi O，Burgess-Brown NA，Colebrook SM，et al.High throughput production of recombinant human proteins for crystallography［J］.Methods Mol Biol，2008,426:221-46.

［6］Eschenfeldt WH，Lucy S，Millard CS，et al.A family of LIC vectors for high-throughput cloning and purification of proteins［J］.Methods Mol Biol，2009,498:105-15.