右玉边鸡体质量相关微卫星标记的筛选

张李俊 ，张 丽 ，张跟喜 ，周胜花 ，丁馥香 ，刘 旗

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原 030032；2.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；3.山西省牧草工作站，山西太原 030001）

微卫星是20世纪80年代末期发展起来的一种新型分子标记。微卫星标记具有数量多、广泛而随机分布于整个基因组中，多态性丰富、相对保守，在进化过程中所受选择压小、呈孟德尔共显性遗传方式、检测容易、快速等特点，被认为是各类遗传标记中最有价值的一种[1-3]。

自微卫星被发现以来，就受到家畜遗传育种学家们的高度重视，并且充分认识到了把它作为畜种的基因组变异研究具有巨大的潜在价值。目前，它在构建遗传连锁图谱、评估遗传多样性、绘制系统发生树、疾病诊断及亲子鉴定等方面显示出巨大的优势，并在人和动植物的遗传研究中得到广泛应用。

高玉时等[4-5]研究了微卫星标记与以隐性白羽鸡和仙居鸡为亲本建立的资源群体的屠宰性状、肉品质性状之间的关系；孙桂荣等[6]研究了微卫星标记与丝羽乌骨鸡产蛋性状之间的关系；徐云翔等[7]研究了微卫星标记与波尔山羊产羔性状的关系；包文斌等[8-9]研究了微卫星标记与仙居鸡12周龄体质量及肉鸡腹脂率的关系。

右玉边鸡是我国著名的地方优良品种资源，也是山西省唯一的地方鸡种，具有抗严寒、耐粗饲、肉质优良、蛋大等特点，是适合于我国北方养殖的优良品种[10-12]。早期建立的保种场由于各种原因现已关闭，只有当地的农户进行少量饲养，因此，样本的采集受到了一定限制，对边鸡的研究工作非常少。

到目前为止，只检索到沈阳农业大学畜牧兽医学院的白文林等[13]运用5个微卫星标记对边鸡进行的研究。运用多个微卫星位点对右玉边鸡的遗传结构及其与生长性状的关系进行研究是非常必要的。鉴于以上原因，我们从右玉县山区的农户家中收集种蛋，在山西省农业科学院畜牧兽医研究所进行孵化，建立了一个保种群体。

本试验分析了右玉边鸡的遗传多样性，并采用方差分析法分析标记基因型与右玉边鸡12，14周龄体质量间的连锁关系，以期找出连锁的微卫星标记，为体质量的QTL定位和标记辅助选择育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

随机选取山西省农业科学院畜牧兽医研究所右玉边鸡保种群140只0世代的右玉边鸡（♂∶♀＝1∶1）血样，翅静脉采集血样1.5 mL，肝素钠抗凝，置冰盒带回实验室，-20℃保存。采用常规苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，对基因组DNA进行OD值测定，并计算其浓度后备用。获得每个个体已测定的12，14周龄的体质量记录。

1.2 引物选择与PCR反应

选用联合国粮农组织（FAO）推荐的29个鸡微卫星标记中的27个，另外2个参照文献[3]的引物。引物由上海生工生物公司合成。所选择的29个微卫星标记的名称列于表1。

PCR扩增反应体系25 μL，包括10 μmol/L引物 2 μL；10×PCR 缓冲液 2.5 μL；2 mmol/L dNTPs 2.5 μL；5 U/μLTaq DNA 聚合酶 0.2 μL；50 ng/μL DNA 模 板 2 μL；25 mmol/L Mg2＋1.5 μL，超纯水 14.3 μL。

PCR扩增程序：94℃预变性6 min；94℃变性 30 s，55～60 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 30 s，30个循环；最后72℃延伸10 min，10℃保存。扩增产物用29∶1的10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法检测电泳结果，UVI凝胶成像系统成像后分析结果。试验所用Taq DNA聚合酶和dNTPs均购自上海生工生物公司，采用pBR322 DNA/BsuRI/Marker作为分子量的标准对照。

1.3 统计分析

通过软件ONE-Dscan分析基因片段大小，Microsatellite-Toolkit软件计算等位基因频率、多态信息含量、观察杂合度与期望杂合度。

根据试验个体微卫星标记基因型和测定的12，14周龄体质量资料，利用SPSS 11.0软件包中的广义线性模型（General Linear Model，GLM）对右玉边鸡12，14周龄的体质量与29个微卫星标记的相关性进行最小二乘方差分析。

2 结果与分析

2.1 微卫星标记的多态性

右玉边鸡29个微卫星标记共检测到143个等位基因，单个位点等位基因数不等，最少的为2个（MCW0103，MCW0037），最多的为 11 个（MCW0104），平均为（4.93±2.20）个。平均多态信息含量和平均期望杂合度分别为0.516 8和0.575 0。

2.2 微卫星标记与体质量的方差分析

29个微卫星标记与右玉边鸡的12，14周龄体质量间的方差分析结果（表1）表明，共检测到10个微卫星标记（MCW0206，MCW0014，ADL0278，MCW0067，MCW0123，MCW0330，MCW0069，MCW0037，MCW0222 和 ADL0112），同时对 12，14周龄体质量具有显著或极显著的影响（P＜0.05或P＜0.01）；标记MCW0034对12周龄体质量具有显著的影响（P＜0.05）；标记LEI0234，MCW0165对14周龄体质量具有显著的影响（P＜0.05）。

表1 标记与右玉边鸡体质量间的方差分析结果（F值）

2.3 9个微卫星标记不同基因型间的多重比较

根据方差分析结果，对与右玉边鸡的体质量关联显著的9个微卫星标记的不同基因型进行了多重比较（表2）。由于微卫星标记MCW0034（19种），LEI0234（29种），ADL0278（15种）和MCW0069（17种）的基因型种类较多，使得很多基因型个体数较少，分析的意义不大，所以本研究未列出多重比较的结果。

此外，微卫星标记MCW0014中基因型187/201，195/201；MCW0123 中基因型 145/149，145/155，145/159；MCW0330 中基因型 260/294，294/294分别只有1个个体，所以在进行多重比较时，对这些数据进行了处理。

从表2可以看出，12周龄时，MCW0206基因型为241/253个体的体质量显著高于基因型为 237/243，237/237的个体（P＜0.05）；14周龄时，MCW0206基因型为241/253个体的体质量显著高于基因型为237/243，237/237的个体（P＜0.05）。因此，等位基因 241，253对 12，14周龄的体质量具有显著的正效应。

12周龄时，MCW0014基因型为199/201，201/201个体的体质量显著高于基因型为187/187，195/195 的个体 （P＜0.05）；基因型199/199的个体体质量介于它们之间，没有达到显著水平。14周龄时，MCW0014基因型为201/201的个体体质量极显著高于基因型为187/187的个体（P＜0.01），显著高于基因型为195/195的个体（P＜0.05）；199/201的个体体质量显著高于基因型为187/187的个体（P＜0.05）。基因型为201/201的个体与基因型为199/201的个体之间差异不显著。因此，等位基因201对12，14周龄的体质量具有显著的正效应。

12周龄时，MCW0067基因型为187/187，181/187的个体体质量显著高于基因型为183/183的个体（P＜0.05），但 183/183的个体只有3个，与其他基因型之间无显著差异；在14周龄时，MCW0067基因型为187/187，181/187的个体体质量显著高于基因型为183/183，181/181的个体（P＜0.05），等位基因187对14周龄的体质量具有显著的正效应。

12，14周龄时，MCW0123基因型为149/153的个体体质量显著高于其他基因型的体质量（P＜0.05），但这种基因型的个体数很少，只检测出2个；MCW0330基因型为260/270的个体体质量显著高于基因型为270/270的个体（P＜0.05）；MCW0037基因型为 157/157，161/161 的2种纯合型个体的体质量显著高于杂合型157/161个体的体质量（P＜0.05）；MCW0222基因型为220/224的个体体质量显著高于其他基因型的体质量（P＜0.05），但这种基因型的个体数很少，只检测出2个；ADL0112基因型为124/130的个体体质量显著高于其他基因型的体质量（P＜0.05），但这种基因型的个体数很少，只检测出2个。

对于MCW0165，多重比较显示，各种基因型之间无显著差异（P＞0.05）。

表2 9个微卫星标记不同基因型在体质量上的多重比较（邓肯氏法）

从表2比较结果可以看出，微卫星标记MCW0014，CW0067和MCW0037的效果最好。MCW0014基因型为201/201的个体12周龄体质量分别比基因型187/187，195/195高出138.44，125.13 g（P＜0.05），14周龄体质量则分别高出241.36 g（P＜0.01） 和 200.07 g（P＜0.05）；MCW0067基因型为187/187的个体14周龄体质量分别比基因型183/183，181/181高出247.05，226.84 g（P＜0.05）。MCW0037 基因型为157/157，61/161的个体12周龄体质量分别比基因型157/161 的个体高出 129.04，131.71 g（P＜0.05），14周龄体质量则分别高出195.54，213.75 g（P＜0.05），157/157型个体与 161/161型个体 12，14周龄体质量差异不显著。

3 结论与讨论

Tatsuda等[14-15]发现，鸡的1号染色体和3号染色体上可能存在控制鸡体质量的QTLs。Gao等[16]利用分布在鸡的23条常染色体和Z染色体上的125个微卫星标记对F2资源群体进行全基因组扫描，发现1号染色体MCW0168和GCT0006标记间存在与体质量相关的QTL。高玉时等[4]研究发现，在鸡 8，3，5，10，13，23 号染色体上存在与活体质量显著相关的标记。

本试验研究中，有3个标记，即MCW0020，ADL0268，MCW0248位于1号染色体上，5个标记（MCW0103，MCW0037，MCW0222，MCW0016，LEI0166）位于3号染色体上，2个标记（MCW0095，ADL0278）位于8号染色体上，2个标记（ADL0112，MCW0067） 位 于 10号 染 色 体 ，1个 标 记（MCW0206） 位于 2号染色体上，1个标记（MCW0014）位于6号染色体上，1个标记（MCW0123） 位于 14号染色体上，1个标记（MCW0330） 位于 17号染色体上，1个标记（MCW0165） 位于 23号染色体上，1个标记（MCW0069）位于26号染色体上。方差分析显示，标记 MCW0206，MCW0014，ADL0278，MCW0067，MCW0123，MCW0330，MCW0069，MCW0037，MCW0222，ADL0112，MCW0034，LEI0234 和MCW0165对12周龄或14周龄体质量有显著的影响，其余标记则差异不显著。

在本研究中，多个标记对12，14周龄体质量具有显著影响，说明体质量性状受多个QTL控制，且效应大小不一。多重比较结果表明，微卫星标记MCW0014，MCW0067和MCW0037的效果最好，而且这3个微卫星标记中，157/157，161/161，201/201，187/187这4种纯合型的个体都占有很大的比例，且不像杂合型个体在群体中难以固定，所以在育种实践中，可以考虑通过选择这样的个体进行留种，在进行人工受精时，进行同型交配产生纯合型的个体。标记MCW0014基因型201/201和标记MCW0037基因型157/157，161/161有望作为12，14周龄体质量的辅助标记，以提高边鸡12，14周龄的体质量。标记MCW0067基因型187/187有望作为14周龄体质量的辅助标记。

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