牛磺酸熊脱氧胆酸对过氧化氢诱导大鼠白内障的影响

王 昆

(佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)

从世界范围来说,白内障(Cataract)是可致盲性眼病中最常见的一种[1]。牛磺酸熊脱氧胆酸具有免疫调节,抗氧化和抗凋亡等多种药理作用。本实验观察 TUDCA作用于离体氧化损伤晶状体后的变化,探讨 TUDCA对过氧化氢诱导大鼠白内障的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

牛磺酸熊脱氧胆酸,TUNEL试剂盒,眼科显微器械,解剖显微镜,光学显微镜

1.2 方法

颈椎脱臼法处死大鼠后取眼球,75%酒精冲洗数秒后,用含 32万 u/L庆大霉素的 PBS溶夜和含 80万 u/L青霉素、100万 u/L链霉素的 PBS溶液各冲洗 10min。在手术显微镜下由后极部剪开巩膜,取出晶状体,放入含 5万 u/L青霉素和 5万 u/L链霉素的培养基中,在 37℃的 5%CO2培养箱中培养 24h,每 12小时更换一次培养液,弃去混浊晶状体,留取透明晶状体以供实验用。以上操作均在无菌条件下进行。采用随机数字表法将上述透明晶状体随机分为以下 5组,每组10个。 A组即空白对照组(将筛选后的透明晶状体置于含10%胎牛血清的 RPM I-1640培养液 2mL的 24孔培养板内,每孔 l个晶状体,置入 37℃,5% CO2培养箱内培养,每 6小时更换 1次培养液,培养 24h)。 B组为 H2O2处理组(在 A组的基础上再加入 3% H2O24.5μL,使其终浓度为 2mmol/mL)。 C组为 TUDCA1实验组 (在 B组的基础上加入浓度为1.0mmol/L的 TUDCA)。 D组为 TUDCA2实验组(在 B组的基础上加入浓度为 2.0mmol/L的 TUDCA)。E组为TUDCA3实验组(在 B组的基础上加入浓度为 3.0mmol/L的 TUDCA)。培养 24h后,制作组织病理切片,用 TUNEL法检测晶状体上皮细胞凋亡情况。

1.3 统计学处理

2 结果

在 400倍光镜下观察每个 TUNEL染色标本,每个标本都计数 5个视野的全部细胞及凋亡细胞数,计算凋亡细胞所占百分比即为晶状体上皮细胞凋亡率。凋亡细胞的细胞核被染成棕色或褐色,而正常细胞的细胞核被染成蓝色。对照组晶状体上皮细胞排列紧密,染色均匀,绝大多数细胞核呈蓝紫色,无明显的凋亡细胞。H2O2组晶状体上皮细胞大小欠均匀,绝大多数细胞核呈棕黄色着染,核固缩,染色质聚集成团,可见大量凋亡细胞。 TUDCA各组晶状体上皮细胞轻度缩小变形,可见部分细胞核呈棕黄色着染,但比 H2O2组减少。经方差分析,各实验组之间两两比较均有显著性差异(P ＜0.05)。测得实验各组的凋亡率见表1。

表1 培养 24h各组晶状体上皮细胞凋亡率(±s,n=10)

表1 培养 24h各组晶状体上皮细胞凋亡率(±s,n=10)

组别 晶状体上皮细胞凋亡率(%)对照组 5.11±0.97 H2O2组 88.64± 4.24 T UDCA1组 69.73± 2.96 T UDCA2组 36.52± 2.41 T UDCA3组 48.31± 3.82

图 1 各组大鼠晶状体上皮细胞凋亡情况(TUN EL×400)

3 讨论

白内障占盲人总数的 47%,其中老年性白内障是最为常见的类型[2],在我国 50～ 60岁的老年人发病率为 60%～70%,大于 70岁者达 80%,大于 80岁者接近 100%[3]。随着人口逐渐趋于老龄化发展,患老年性白内障的人还会有增无减。白内障的发病机理颇为复杂,普遍认为自由基引起的氧化损伤与其发病机制密切相关,LECs凋亡可能是白内障形成的共同细胞学基础(先天性白内障除外)[4]。 H2O2可使细胞氧化还原反应位点向着氧化型方向发展,细胞膜功能障碍,DN A结构破坏,钙离子泵失调,细胞内高钙激活细胞凋亡程序使晶状体上皮细胞明显减少,晶状体渗透压失衡严重影响晶状体纤维的透明性和完整性,同时由于晶状体上皮细胞不完整,使细胞骨架降解,蛋白聚集,膜通透性增加水和电解质进入细胞内,引起核和皮质混浊白内障形成。

TUDCA是一种亲水性的结合型次级胆汁酸,正常生理状态下 ,人体内源性 TUDCA的水平很低,它是 UDCA的衍生物,其化学名称为 3a,7 β-二羟基胆烷酰-N-牛磺酸 ,是由熊脱氧胆酸与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型天然胆汁酸,广泛存在于人和动物胆汁中,常常用于胆汁淤积综合征的胆酸替代治疗,其机制主要是稳定线粒体膜、阻止细胞色素 C释放、阻止 Caspase-3、Caspase-9活化、激活 Ca2+介导的 PKC、MAPK和 PI3K途径等[5]。体内外的研究显示,TUDCA比 UDCA对细胞的保护作用更强。TUDCA的药理用途广泛,主要是保护肝细胞,促进胆汁酸转运和分泌[6],拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒作用 ,抗炎作用,抗氧化作用,清除自由基,还可以通过调控细胞凋亡的经典途径减少细胞的程序化死亡,TUDCA对多种细胞和组织都有保护作用,其抗凋亡性质具有广泛性,提示 TUDCA不但可以用于肝细胞凋亡相关性疾病的治疗,而且还可以用于治疗与凋亡相关的其他疾病。本实验用 H2O2诱导大鼠白内障快速形成,结果显示,不同 TUDCA浓度组晶状体上皮细胞的凋亡率均低于过氧化氢组(P＜0.05),提示 TUDCA能降低晶状体上皮细胞的凋亡率,从而抑制离体大鼠氧化损伤白内障的发展。从晶状体上皮细胞凋亡率结果中还可以看出,TUDCA2组对抗晶状体上皮细胞凋亡的作用最强,TUDCA3组反而降低,由此可见,2.0mmol/L的 TUDCA可能是理想的有效浓度。在不远的将来 TUDCA有可能成为新的治疗白内障药物。但是,TUDCA应用于体外培养的动物模型与应用于活体的白内障患者作用是否相同,毒副作用及具体的作用机制等问题都需要进一步的研究。

[1] Arnal E,Miranda M,Almansa I,et al.Lutein prevents cataract development and progression in diabetic rats[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2009,247:115-120

[2] 葛坚.眼科学 [M].北京:人民卫生出版社,2005,209-217

[3] 陶丹,王雪梅,雷霍.年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中hT ERT的活性表达 [J].中国医药导报,2010,7(28):19-20

[4] 李春丽,鲁建华,张文芳.紫外线对大鼠晶状体泛素 mRNA表达水平的影响 [J].眼外伤职业眼病杂志(附眼科手术),2009,31(6):405-407

[5] 李杰,茅晓东,刘翠萍,等.牛磺熊脱氧胆酸在棕榈酸诱导的 INS-1细胞凋亡的作用 [J].生态毒理学报,2010,5(3):407-413

[6] Dombrowski F,Stieger B,Beuers U.Tauroursode-oxycholic acid inserts the bile salt export pump into canalicular membranes of cholestatic rat liver[J].Lab Invest,2006,86:166-174