托吡酯对海人酸致痫大鼠海马组织 P-糖蛋白和核转录因子表达的影响

王海燕,张英琦,迟瑛娇,聂 磊,王丽敏

(佳木斯大学附属第一医院儿内二科,黑龙江 佳木斯 154003)

目前 ,难治性癫痫(intractable epilepsy,IE,RE)发病机理不十分清楚,其中研究最多的是多药耐药基因1(multidrug-resistance 1,mdrl)及其编码的能量依赖性转运蛋白 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)通过改变药物运输对 MDR形成的影响[1]。近年来随着研究的深入,发现多药耐药的发生也与神经网络重组有关,NF-κB(nuclear factor of kappa B)是一种重要的核转录因子,在神经网络重组方面起着关键作用[2～4]。但有关 RE脑组织 NF-κ B水平变化及其托吡酯(TPM)对其表达的影响国内外报道甚少。

本实验通过建立大鼠海人酸(Kainic acid,KA)致痫模型,应用免疫组化方法测定海马 P-gp和 N F-κ B的表达及TPM对其表达的影响 ,以探讨 P-gp和 NF-κ B是否参与RE的耐药机制,从而使 N F-κ B有可能成为 RE治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

健康的 Wistar大鼠 84只,体重 200～ 250g雌雄不拘,由佳木斯大学动物实验中心提供。KA购自美国 Sigma公司;P-gp、NF-κ B免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组:将84只大鼠随机分为3组:生理盐水对照组24只;KA组30只;TPM治疗组30只,在应用 KA前每天给TPM治疗组大鼠灌胃一次,至第14d灌胃后2h注射 KA。每组再分为 6h、24h、3d3个时间组。

1.2.2 动物模型制作及大鼠惊厥分级:将大鼠麻醉后固定于脑立体定向仪上,头颅正中切口,暴露前囟,将进样器针尖抵住前囟位置读出 X,Y,Z的原始值视为原点,依大鼠立体定向图谱,所确定的目标即右侧海马 CA3区:X-4.5mm,Y+4.5mm,Z硬膜下4mm,调整 XY坐标,显露硬膜,在调整 Z值至硬膜下4mm。通过微量进样器半分钟内缓慢注入KA1 μL,留针3～ 5min。癫痫发作分级参考 Racine[5]的标准进行分级。

1.2.3 标本的制作:分别于 KA注药后 6h、24h、3d时间点,予 4%多聚甲醛溶液灌注取脑 (双侧海马),放入4%多聚甲醛溶液中保存待测。常规脱水、透明、浸蜡、包埋,连续切片备用。

1.2.4 免疫组化染色:采用免疫组织化学方法(ABC),防脱处理;常规脱蜡;灭活内源性酶;修复抗原;滴加正常山羊血清封闭液室温20min。按步骤先后滴加适当稀释的Ⅰ抗(兔抗鼠 Pgp,N F-ΚB)和生物素Ⅱ抗;DAB显色,充分水洗;苏木素复染;乙醇梯度脱水、透明;中性树胶封片观察。P-gp阳性细胞为细胞浆出现棕黄色,N F-κB免疫反应阳性细胞为细胞核染成棕黄色或有棕黄色沉积。每张切片在200倍显微镜下观察海马阳性细胞数,随机选取6个视野计数阳性细胞数求其平均数。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠海马区 P-gp表达结果

以胶质细胞胞浆内出现棕黄色物质为 P-gp阳性表达细胞。KA组 P-gp的表达较对照组明显增高 (P＜0.01),P-gp的表达在 KA注射6h后升高 (P ＜0.01),24h时达高峰 (P＜0.01),3d时下降但仍然高于6h组 (P＜0.01);TPM组 P-gp的表达与 KA组各时间点比较无显著差异(P ＞ 0.05)。(见表1)。

表1 各组大鼠不同时间点海马 P-gp阳性神经元细胞计数比较 ±s)

表1 各组大鼠不同时间点海马 P-gp阳性神经元细胞计数比较 ±s)

注:与对照组比较,*P＜0.01;与 K A组比较,#P＞ 0.05。

组别 6h 24h 3d对照组 2.10± 0.742.06± 0.612.08± 0.78 KA组 3.66± 0.62* 18.66± 2.84* 11.21± 1.75*T PM组 4.01± 0.36*# 19.06±2.06*# 11.96± 2.62*#F值 25.69117.6268.55 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 各组大鼠海马区 NF-κB表达结果

KA组 N F-κ B的表达比对照组明显增高 (P ＜0.01),N F-κ B的表达在 KA注射 6h后升高,24h时达高峰(P ＜0.01),3d时仍维持较高水平;TPM组 N F-κB的表达与 KA组各时间点比较无显著差异 (P＞ 0.05)。(见表2)。

表2 不同处理组在不同时间海马 N F-κ B阳性神经元细胞个数比较 ±s)

表2 不同处理组在不同时间海马 N F-κ B阳性神经元细胞个数比较 ±s)

注:与对照组比较,*P ＜0.01;与 K A组比较,#P＞ 0.05。

组别 6h 24h 3d对照组 1.87± 0.291.70± 0.111.81±0.30 KA组 4.73± 0.68* 24.28± 2.09* 24.16± 2.56*T PM组 4.50± 0.86*# 23.96± 3.92*# 22.617± 2.58*#F值 57.77200.55278.23 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 N F-κ B与 P-gp蛋白在 KA模型海马组织中表达的关系

在 KA模型海马组织中 N F-κ B与 P-gp的表达呈正相关 (r= 0.86,P ＜ 0.01)。

3 讨论

众所周知,RE对抗癫痫药物治疗不敏感,主要 MDR1有关。MDR1编码 P-gp表达,P-gp实际上是 AT P依赖性药物排出泵,能将药物从细胞内泵出,降低细胞内药物浓度,减轻细胞毒作用,从而产生多药耐药现象,P-gp的过度表达是引起难治性癫痫多药耐药的主要原因。Seegers等[6]在大鼠颞叶癫痫的海人酸(KA)模型中检测 P-gp在海马以及其他脑区表达的时间进程。在癫痫状态后24h,齿状回的内皮细胞和海马的 CAl和 CA3区的实质细胞可见 P-gp的表达明显升高。本实验结果显示:KA模型组 P-gp的表达明显升高,这与国内外研究结果基本一致。Crespel[7]利用合并海马硬化的颞叶癫痫患者术后病理切片进行免疫组化分析发现,胶质细胞和大脑锥体细胞 N F-κ BP65过度表达 ,并推测癫痫形成过程是由 NF-κB介导的炎症反应过程,其过程是一个被痫样发作反复、短暂激活的慢性过程。Matsuoka等[8]利用大鼠海人藻酸点燃模型发现痫性发作后4～ 16h内海马神经元N F-κB活化明显增加,并伴胶质细胞 NF-κB持续活化。本实验结果显示:KA模型组海马 N F-κB表达显著升高,这与国外大鼠癫痫发作使海马神经元 NF-κ B活化明显增加的研究结果相符合。本实验同时在海人酸(Kainate)大鼠模型脑组织中检测 NF-кB和 P-gp蛋白的表达,发现了 N F-кB和 P-gp的表达呈正相关。综上分析,N F-κ B参与 RE多药耐药可能的机制:一方面 N F-κ B是一种重要的核转录因子,调控着多种基因的表达,而 N F-кB和 P-gp的表达密切正相关则提示 MDR1有可能是 N F-к B下游基因之一,在 N F-к B的调节激活转录下 ,过度表达 P-gp蛋白而引起RE多药耐药。事实上,Bentires-Alj等[9]证实了 MDR1启动子区域的第一外显子包含一个纯化的 N F-к B结合序列 (‘5-CCTT TCGGGG-3’),而 NF-кB也的确能够激活连接MDR1启动子的基因转录。另一方面,神经网络重组可导致RE多药耐药的形成,因此与神经元的可塑性有关的因子在RE多药耐药形成中起着一定的作用。以往研究发现 AEDs中的卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥使 P-gp的表达上调;而拉莫三嗪、托吡酯则不上调 P—gp的表达[10]。本实验结果显示各时间点 TPM组与 KA组比较仅有上升的趋势,但无统计学意义,这与王等人研究的结果是一致的。推测 KA致癫痫大鼠海马组织 P-gp的过度表达是癫痫发作的结果,与TPM无关,即 T PM不上调 P-gp的表达。本实验中,TPM组 N F-κ BP65蛋白表达与 KA组相比,无显著差异,提示TPM抗癫痫的作用过程可能与 NF-κ B无直接相关,或者存在其他复杂的分子调控机制参与这些抗癫痫药的作用过程。关于 TPM作用机制与 N F-κB的关系研究目前少有报道,NF-κ B在 KA点燃癫痫模型中海马组织的表达变化规律以及与癫痫脑损伤和脑保护的关系值得进一步深入探讨。

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