慢性肺源性心脏病患者外周血中 Th17的初步研究

鲍文华,许 君,阎红娥,孙云晖

(佳木斯大学附属第一医院呼吸科,黑龙江 佳木斯 154003)

慢性肺源性心脏病(CPHD)是一种多病因、发病机制复杂化的疾病,呈慢性进行性发展,严重危害人类健康。近年来,细胞因子在其发病中的作用逐渐受到重视。一种新的CD4+T细胞亚群(Th17细胞亚群)成为研究的热点[1]。据报道 Th17细胞在自身免疫性疾病,防御多种病原体感染、介导慢性炎症等疾病中发挥重要作用[2,3],但在 CPHD的研究各文献中尚未见报道。本实验将利用流式细胞技术检测 Th17细胞在 CPHD患者外周血中的表达,为进一步探讨 CPHD的发病机制及寻求新的治疗方法,减少病死率提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择标准

按第三次全国肺心病会议制定的慢性肺源性心脏病诊断标准选择患者;排除入院前曾口服或静脉给予激素治疗者,合并糖尿病,肝炎,肺结核,冠心病,心肌病 ,肿瘤,甲状腺功能亢进者,自身免疫性疾病患者等;对照组选择体检健康者。

1.2 一般资料

选择佳木斯大学附属第一医院呼吸内科2010-11～2011-07住院的 CPHD 患者 34例 ,女 20例 ,男 14例 ,年龄 48～81岁,平均(61.50±10.90)岁。刚入院患者急性加重期为加重期组,经治疗好转即将出院患者为缓解期组。对照组20例,男 9例 ,女 11例 ,年龄 45～ 72岁 ,平均 (57.35± 8.46)岁 ,为同期体检健康者。本研究争得本院伦理委员会支持,研究对象知情,同意配合。

1.3 试剂与仪器

主要试剂:异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人 CD4抗体;藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人 IL-17A抗体;Mouse IgG1PE同型对照抗体;固定ㄍ透膜试剂盒;佛波酯(PM A)、离子霉素、均购自美国 BD Biosciences公司,人淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程研究所。主要仪器:BD FACS Aria TM Cell Sorter购自美国 BD公司;低速台式大容量离心机购自上海安亭科学仪器厂;CO2 INCUBATOR购自 Gold-SIM(U SA)INTERN ATIOANL GROUP CO.LTD.

1.4 Th17细胞检测

所有受试者晨起空腹采静脉血2mL,将采集的标本置于肝素钠抗凝管中,用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)将血液1:1稀释。应用人淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBM C)后加 5倍以上 1640培养基 ,将其离心去清加 1mL含10%胎牛血清的1640完全培养基,100ng/mL离子霉素 ,1μg/mL PM A,1 μL蛋白转运抑制剂,混匀置入含有5%CO2、37℃的孵育箱中6h。结束后分为测定管及对照管,分别加入10μL抗人 CD4单抗,4℃暗处孵育30min,洗涤2次后对细胞固定透膜处理以便进行细胞因子染色。在测定管加抗人白细胞介素17A10μL,对照管加同型对照抗体,置于4℃避光30min,洗涤去清后加300μL PBS充分混匀,应用流式细胞仪分析。

1.5 统计学处理

2 结果

慢性肺源性心脏病患者外周血中 Th17的表达:患者外周血加重期组 Th17/CD4+T细胞的比例明显高于缓解期组及对照组 (P＜0.01),缓解期组与对照组之间无显著差异(P ＞ 0.05)(表1)。

表1 CPHD加重期组与缓解期组、对照组Th17/CD4+T细胞的比较(±s)

表1 CPHD加重期组与缓解期组、对照组Th17/CD4+T细胞的比较(±s)

注:与加重期组比较*P＜0.01,与对照组比较△P＞ 0.05。

组别 n Th17/CD4+T细胞(%)加重期组 342.36±0.96缓解期组 340.89± 0.40△*对照组 201.03±0.48*

3 讨论

CPHD是一种继发性心脏病,该病易反复,并发症多 ,治疗不理想,许多学者致力于与炎症、免疫细胞功能失调等研究,例如对免疫球蛋白含量、自然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞活性,T细胞亚群的百分率及 T细胞转化率的测定[4]。 2003年,Aggarwal S.等发现人类存在 Th17细胞。大量研究证实该细胞主要分泌 IL-17A、IL-17F、IL-6、TNF-α、IL-21和 IL-22。IL-17A是一种致炎细胞因子[5],是诱导炎症反应的启动因子,可以刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生 IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和细胞黏附分子1(cellular adhesion molecule 1,CAM-1)等,也可以聚集并活化中性粒细胞,在炎症及气道重塑中发挥重要作用。随着对 Th17细胞生物学特性、分化及调节机制的探讨,证实了 Th17细胞分泌的 IL-17A在多种自身免疫病及炎性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病以及哮喘、慢性阻塞性肺疾病患者的血清或组织中高表达[6,7]。也有学者应用流式细胞技术观察到慢性心力衰竭(CHF)患者外周血中 Th17细胞比例显著增高,表明与 CHF发生发展及恶化密切相关[8]。 本研究中我们观察到 CPHD患者急性加重期外周血 Th17/CD4+T细胞的比例明显高于缓解期及对照组,表明 Th17细胞的变化与CPHD有一定关系,可能因为 Th17细胞的增加,直接和间接释放大量效应因子,引起机体免疫应答,进而放大并促进炎症反应 ,从而引起肺组织及心肌细胞损害。推测 Th17细胞的增加参与 CPHD的发生发展,我们可以通过对 Th17细胞的检测来了解疾病的转归,为 CPHD预防和治疗提供新靶点。

[1] Aggarwal,S.,Ghilardi,N.,Xie M H,et al.Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin- 17[J].Biol Chem,2003,278(3):1910-1914

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