Livin及 NF-kbp65在非小细胞肺癌中的表达及意义

阎红娥,姜文玉,鲍文华,王春玲

(佳木斯大学附属第一医院呼吸科,黑龙江 佳木斯 154003)

恶性肿瘤的发生不仅与肿瘤细胞的异常增殖及分化有关,而且与细胞凋亡调节紊乱所导致的细胞凋亡受抑制也有关,凋亡通路的紊乱、凋亡因子的抑制、凋亡因子的过表达以及凋亡基因的表达失控都会导致肿瘤的发生和发展。成为恶性肿瘤形成的重要机制之一。Livin是新近发现的一种凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成员之一,特异性表达于人的胚胎组织及大多数恶性肿瘤细胞,如黑色素瘤、白血病、前列腺癌及膀胱癌等,其在正常成人组织中低或无表达,提示该基因在肿瘤细胞的增殖和凋亡过程起着重要作用[1～4]。核因子 - κB(nuclear factor kappa B,N F- κ B)是1986年 Sen等[5]首先从成熟 B淋巴细胞核抽取物中检出的,可与免疫球蛋白 k链基因的增强子序列特异性结合并促使 k链基因转录的核蛋白因子,其广泛存在于真核细胞,是一种具有多向调节功能的转录因子,主要通过启动和调节多种肿瘤相关基因的转录从而调控细胞的增殖、分化、凋亡及转移,目前的研究认为它与炎症、免疫反应、创伤、细胞增殖、细胞凋亡以及胚胎发育等重要事件有着密切联系。N F-κ Bp65是它的活性成分,调控一系列基因的表达。本文旨在运用免疫组化方法测定非小细胞肺癌(NSCLC)组织中 Livin、NF-κBp65的表达及在肺癌发生发展中的作用及其相互之间的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

随机选取佳木斯大学附属第一医院 2009— 02～ 2011—02手术切除 NSCLC组织标本40例,其中鳞癌 30例,腺癌10例;高、中分化29例,低分化11例;按 UICC1997肺癌分期标准分期 ,Ⅰ 、Ⅱ 期 27例 ,Ⅲ 期 13例 ;男 25例 ,女 15例;有淋巴 结转移的21例 ,无淋巴结转移的19例;均为原发性肺癌,且术前未接受放化疗,取10例癌旁正常肺组织作为对照。

1.2 试剂

Livin多克隆抗体(bs-0738R)、N F-κBp65兔抗人单克隆抗体(bs-0465R)均购自北京博奥森生物技术有限公司,SP免疫组织化试剂盒(KIT-9710)和 DAB显色试剂盒(DAB-0031)均购自福州迈新生物技术公司。

1.3 实验方法

肺癌标本经福尔马林液固定、常规石蜡包埋。每例连续切片 3张 ,切片厚 4 μm,供常规 HE染色和 Livin、NF-κBp65免疫组织化学染色。Livin多克隆抗体浓度为1：500,N F-κBp65兔抗人多克隆抗体浓度为1：500。参照检测试剂盒说明进行。

1.4 结果判断标准

两种蛋白染色阳性均为棕黄色,均表达于细胞浆。在10× 40高倍视野下,随机选 10个视野 ,计数肿瘤细胞中阳性比例计算百分率,阳性细胞 ＜10%记为(-);阳性细胞数在10%～ 25%记为 (+);阳性细胞数在 25%～50%记为(++);阳性细胞数＞ 50%记为(+++)。

1.5 统计学处理

应用 SPSS17.0统计分析软件进行统计学处理。采用i2检验和 Spearman等级相关分析,P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织中 Livin、NF- κ Bp65的表达

在 40例 N SCLC组织中,31例癌细胞 Livin呈阳性 [(+ )～ (+++)]表达,阳性率为77.5%;26例癌细胞 NF-kBp65呈阳性 [(+)～ (+++ )]表达,阳性率为65%。15例癌旁正常肺组织 Livin、NF-κ Bp65阳性率分别为 16.7%、26.5%。Livin和 NF-κBp65阳性均表达于癌细胞胞浆中,为棕黄色,间质和血管均未见表达 (见图1～ 4)。

图4 N F- κ Bp65在肺腺癌细胞中表达(SP×200)

2.2 肺癌组织中 livin、NF-kBp65的表达与临床病理因素的关系

Livin的表达水平与肺癌的病理类型、有无淋巴结转移(P ＜0.05)相关,与患者的性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期、分化程度无明显相关性 (P＞ 0.05)。NF-κBp65的表达水平与肺癌分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移密切相关(P ＜0.05),与患者的性别、年龄、病理类型、肿瘤直径无明显相关性 (P＞ 0.05),见表1。

表1 肺癌组织中 Livin、N F- κ Bp65的表达与临床病理因素的关系

3 讨论

Livin是2000年 Lin等[1]根据 IAPs基因同源序列,在人的胎肾 cDN A文库中发现的新成员,当时将其命名为 KIAP(Kidney inhibitor of apoptosis protein);2001年 Kasof等[2]将之命名为 Livin并沿用至今。Livin位于染色体 20q13,全长46kb,Livin蛋白 N端仅包含一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列 BIR结构,C端含一个 R ING环指结构,由于剪接方式不同分为两种亚型,Livin a及 Livinβ。其表达分布又有不同,β亚型表达主要存在于胎儿肾脏组织中,而α亚型在其中尚未发现表达。在正常成人的大脑、骨骼肌、外周血淋巴细胞中可发现α亚型的表达,但表达水平较低。

本研究显示,Livin蛋白在 NSCLC组织中的阳性表达率明显高于癌旁肺组织,提示 Livin在肺癌发生中起一定作用;腺癌高于鳞癌、有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者,与陈晓等[6]的报道一致,提示 Livin可能在肿瘤的转移中起作用;Livin表达与肺癌 TNM分期无关,与陈晓等[6]的报道不同,可能与该实验样本较少及标本选择有关,有待于以后大样本中继续研究。本实验表明 Livin与肺癌组织学类型、浸润及转移相关,与瘤体大小、患者年龄、TNM分期无明显相关性,可能成为肺癌检测及治疗的新靶点。

N F-κ B是一种核转录因子,通常和抑制蛋白 IKB组成无活性的 N F-κ B/IKB三聚体形式,在一些因素刺激下 IKB发生磷酸化后降解[7],从而使 N F-κ B被激活,当细胞受生长因子、白介素1(IL-1)、致癌物等的刺激时,IKB泛素化继而被蛋白酶水解,活化的 P65进入细胞核,与κB结合位点结合启动转录。本研究结果显示,在正常肺组织中 ,NF-κBp65阳性表达率明显弱于肿瘤组织,说明在非肿瘤组织中 N F-κBp65处于不断的激活和失活的有序调控中,而在肿瘤组织中 N F-κ Bp65失去控制而被过度激活,从而导致细胞过度增殖,进而引起肿瘤的发生。本实验结果显示 NF-κ Bp65在低分化 NSCLC组织中的阳性表达率明显高于中、高分化肺癌组织,提示 N F-κBp65的高表达与 NSCLC的恶性程度密切相关。有区域淋巴结转移组 N F-κBp65表达明显高于无淋巴结转移组,也提示了 N F-κBp65过度活化与 N SCLC的侵袭、转移相关,N F-κBp65高表达促进了 N SCLC淋巴结转移。本研究结果表明,NF-κ Bp65表达与病人性别、年龄、组织学类型无明显相关性,而与瘤体大小分、分化程度、有无淋巴结转移有关。

Livin是目前唯一一个证实能够直接与 Caspase-3结合的蛋白,通过 BIR结构域直接抑制 Caspase-3发挥抗凋亡的作用。Kasof等[1]研究认为 Livin通过 BIR结构域可与介导细胞凋亡的下游的效应 Caspase(Caspase-3和 Caspase-7)结合,抑制其活性。最近有学者[8]发现 livin主要通过 caspase活性参与肿瘤坏死因子(TN F)介导的信号传导诱导核转录因子 NF-κ B的激活从而发挥抗凋亡效应。同时一些研究表明,NF-κ B也具有抗凋亡的作用,其抗凋亡作用可能通过上调编码抗凋亡的因子。因此二者之间存在某种相关性,共同促进肿瘤的发生及发展。本试验通过对非小细胞肺癌组织中 livin与 NF-κ Bp65的表达进行检测分析 ,证实 Livin在NSCLC组织中阳性率为77.5%,livin高表达与肺癌分化程度相关 (P＜0.05),同时 NF-κBp65在 NSCLC组织中阳性率为65%,NF-κBp65的高表达与肺癌淋巴结转移相关(P＜0.05),Livin和 N F-κ Bp65表达具呈显著正相关(r= 0.265,P ＜0.05)。综上所述 ,我们的研究提示 N F-κBp65可能通过上调 Livin的表达,抑制细胞凋亡 ,从而增加肿瘤细胞的增殖,成为其促进肺癌发生发展的可能途径之一。

[1] Kasof GM,Gomes BC.Livin,a novel in hibitor of apoptosis protein family member[J].J Biol Chem,2001,276(5):3238-3246

[2] L in JH,Deng G,Huang Q,et al.KIAP,a novelm ember of the inhibitor of apoptosis protein family[J].Biochem and Biophys Com,2000,279:820-831

[3] Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro M T,et al.ML- IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expresses in hum an melanom as[J].Current Biol,2000,10:1359-1366

[4] Ashhab Y,Alian A,Polliack A,et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissued istribution pattern[J].Mol Cell,2003,11(3):551-552

[5] Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immuno globulin enhancer sequences[J].Cell,1986,46(5):705-716

[6] 陈晓,杨春鹿,赵君.非小细胞肺癌组织中 Livin和 Smac蛋白表达及其临床意义的研究 [J].中华肿瘤防治杂志,2008,15(12):905-909

[7] Laurence J,Murat T.NF- B signaling pros and cons of altering NF-κ B as a therapeutic approach[J].Ann N Y Acad Sci,2006,1072:114-122

[8] Wang Q,Wang X,Evers BM.Induction of c IAP22 in human colon cancer cells through PKC delta/N F2kappa B[J].J Biol Chem,2003,278(51):51091-51099