连环蛋白p120在人胰腺癌组织中的表达及其意义

桂德春，程张军，周家华

(东南大学附属中大医院普外科，江苏南京 210009)

E-钙黏蛋白(E-cadherin)是一种介导细胞间相互黏附、维持组织结构完整性的跨膜蛋白，可与连环蛋白p120(p120ctn)等结合构成钙黏蛋白-连环蛋白复合体(cadherin catenin complex，CCC)，该复合体在维持上皮细胞间黏附力和上皮组织结构完整性方面发挥巨大作用，而p120ctn又为维系复合体完整性的核心所在。研究发现，在多种肿瘤中，胞膜上E-cadherin会随着p120ctn的丢失而迅速减少、丢失［1］。在p120ctn丢失的情况下，E-cadherin则会变得很不稳定，从而导致整个钙黏蛋白-连环蛋白复合体的稳定性大大减弱，进一步影响肿瘤发展、浸润和转移。目前，在胰腺癌中，有关p120ctn的表达情况及其可能的作用和机制报道较少，尚缺乏深入研究。本研究收集53例人胰腺癌组织标本及相应临床病理资料，利用免疫组化法检测胰腺癌和癌旁胰腺组织中p120ctn和E-cadherin、微血管密度(MVD)的表达情况，分析p120ctn的异常表达与临床病理特征的关系及其对患者预后的影响，探讨p120ctn在胰腺癌侵袭转移中的作用及可能的机制，为寻找胰腺癌分子靶向治疗提供有效的研究平台。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2004年1月到2010年1月间由东南大学附属中大医院和第二军医大学附属长海医院普外科手术切除的胰腺癌标本53例，其中男31例，女22例，年龄40～87岁，平均(65.0 ±11.4)岁，术前均未接受抗肿瘤治疗。胰腺癌组织标本按照国际抗癌联盟(UICC)2010版关于TNM分期系统［2］进行临床分期。所有胰腺癌组织标本均经病理学检查证实为胰腺癌，癌旁胰腺组织要求距肿瘤边缘至少2 cm。所有病例均有完整的术后随访记录，生存时间从手术日期到由于复发或转移而死亡的日期为止。

1.2 免疫组化

组织标本采用40 g·L－1中性甲醛固定，12 h后行石蜡包埋后进行连续切片，厚度为4 μm，常规脱蜡脱苯、水化，组织切片行抗原高压热修复。免疫组化SP法，抗 p120ctn单克隆抗体工作浓度 1∶400，抗 E-cadherin及CD34单克隆抗体工作浓度均为1∶100。经过一系列处理后，最终树脂封片后观察结果。每次实验均以已知阳性切片为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果评估

p120ctn表达结果的判断参考文献［3］。(1)正常表达:细胞呈连续的膜染色，而胞质无染色，且膜阳性细胞＞90%;(2)异常表达:膜表达缺失或减弱，或不连续或膜阳性细胞 ＜90%，胞质出现表达。E-cadherin［3］以胞膜出现棕黄色染色为阳性细胞，＜90%的肿瘤细胞染色判定为E-cadherin异常表达，＞90%的肿瘤细胞染色为E-cadherin正常表达。CD34及MVD 值采用 Weidner法［4］判断。

1.4 统计学处理

采用SPSS 11.5统计分析软件，p120ctn的表达与MVD之间的关系采用t检验，p120ctn与临床病理因素的关系用χ2值检验或Fisher精确概率检验，p120ctn与E-cadherin表达的关系用Spearman秩和检验。生存分析采用Kaplan-Meier法，用Log-rank检验判断差异性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 p120ctn、E-cadherin及MVD在胰腺癌和癌旁胰腺组织中的表达

免疫组化结果显示，p120ctn在胰腺癌组织中出现定位表达异常，主要表现为胞质表达和(或)膜表达减弱或缺失，异常表达率为64.1%(34/53)，但并未发现细胞核的表达;而在癌旁胰腺组织中，p120ctn主要表现为胞膜连续性表达(46/53)，异常表达率仅约为13.2%(7/53)。两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)(图1A、B)。与 p120ctn一样，E-cadherin的表达也呈现类似的特征。在胰腺癌组织中，E-cadherin异常表达率约为56.6%(30/53)，而在癌旁胰腺组织中异常表达率为16.9%(9/53)，差异具有统计学意义(P ＜0.05)(图1C、D)。此外，我们还发现，MVD 值的表达水平在胰腺癌及癌旁正常组织中也存在明显差异，两者之间差异具有统计学意义(P＜0.05)(图1E、F)。

图1 p120ctn、E-cadherin和MVD在胰腺癌和癌旁胰腺组织中的表达Fig 1 Expression of p120ctn，E-cadherin and MVD in tumor tissue and in normal tissue

2.2 胰腺癌组织中p120ctn与E-cadherin、MVD表达的相关性分析

免疫组化结果显示，53例胰腺癌组织中，有25例组织在p120ctn表达丢失和减弱的同时出现了E-cadherin的表达异常。同样，在14例p120ctn表达正常的组织中，E-cadherin表达也未见异常。通过进一步统计分析的结果表明，在胰腺癌组织中，p120ctn与E-cadherin的表达呈明显正相关(r=0.457，P＜0.05)。同样，即p120ctn的表达与MVD值的表达水平也存在一定的联系。p120ctn异常表达组MVD值为49.29±6.86，明显高于正常表达组的 MVD 值(13.80±2.92)，两组之间表达差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 胰腺癌组织中p120ctn的表达与临床病理特征的关系

实验结果显示，在胰腺癌组织中p120ctn异常表达，不仅与组织分化程度有关，而且还与淋巴结转移及TNM分期有关(P＜0.05)。主要表现为:分化程度越低，异常表达率越高;有淋巴结转移者异常表达率较无淋巴结转移者高;Ⅲ、Ⅳ期患者胰腺癌组织中异常表达率较Ⅰ、Ⅱ期的高。p120ctn异常表达与患者性别、年龄、病变部位、肿瘤大小均无关(P＞0.05)。见表1。

表1 p120ctn的表达与临床病理特征的关系Tab 1 Relationship between p120ctn expression and clinicopathological characteristics

2.4 p120ctn的异常表达水平与胰腺癌患者的预后

对53例胰腺癌患者进行随访，并用Kaplan-Meier生存曲线进行分析。结果表明，p120ctn异常表达组患者的中位生存时间为(12.9±2.5)个月，明显低于正常表达组的生存时间［(25.0±5.7)个月］。这表明，与p120ctn正常表达组相比，异常表达组预后明显较差，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)。

图2 不同p120ctn表达的胰腺癌患者的生存曲线(Kaplan-Meier曲线)Fig 2 Survival curves of patients with pancreatic carcinoma，according to the different expression of p120ctn(Kaplan-Meier)

3 讨 论

胰腺癌因具有恶性程度高、早期诊断困难等特点，患者术后5年生存率不足5%。究其原因，胰腺癌早期即发生侵袭、转移是主要因素之一。因此，如何有效控制肿瘤细胞侵袭、转移，已为提高胰腺癌患者手术切除率和术后生存率的关键所在。

引起肿瘤侵袭、转移因素众多，而细胞间黏附力的改变在人类肿瘤的侵袭、转移中所起作用的研究较为广泛。研究表明，由p120ctn与E-cadherin等所构成的钙黏蛋白—连环蛋白复合体，在维持上皮细胞间黏附力及上皮组织结构完整性中作用巨大，而连环蛋白p120对维系整个复合物的完整又起着至关重要的作用。在正常组织中，p120ctn主要分布于胞膜上，极少有细胞质和胞核分布。近年来，人们陆续发现，在部分肿瘤如胃癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌和口腔癌等中有p120ctn胞膜表达减少或丢失的报道［5］，并且会导致肿瘤侵袭转移表型的改变，甚至影响病人的预后。在胰腺癌中该蛋白是否亦存在异常表达，以及这种异常表达是否可能成为影响患者预后的主因等尚未得到明确证实。

本研究对53例具有完整临床病理资料的胰腺癌组织标本进行免疫组化检测发现，p120ctn在胰腺癌组织中出现定位表达异常，主要表现为胞质表达和胞膜表达减弱或缺失，异常表达率为64.1%(34/53)，但并未发现细胞核的表达;而在癌旁胰腺组织中，p120ctn主要表现为胞膜连续性表达(46/53)，异常表达率仅为13.2%(7/53)，两者比较差异有统计学意义。p120ctn最重要的功能是维持 E-cadherin的数量，p120ctn缺失会导致膜上E-cadherin被迅速降解，从而降低细胞间黏附力，促进肿瘤转移。本研究结果表明，与p120ctn类似，E-cadherin在癌旁胰腺组织中胞膜表达率为83.1%(44/53)，异常表达率仅为16.9%(9/53)，而在胰腺癌组织中异常表达率却为56.6%(30/53)，明显高于癌旁胰腺组织。进一步分析表明，p120ctn与E-cadherin在胰腺癌组织中的异常表达呈正相关，这与在其他肿瘤中所发现的现象［6］相一致，进一步证实了两种蛋白之间的“共存”关系。

多项研究［7－9］表明，p120ctn异常表达与肿瘤患者的临床病理特征密切相关，且可大大影响患者的生存时间。本研究通过对胰腺癌组织中p120ctn的异常表达与临床病理特征的关系的分析发现，p120ctn异常表达不仅与组织分化程度有关，而且与淋巴结转移及TNM分期有关，但与患者性别、年龄、病变部位、大小均无关。此外，p120ctn异常表达与患者生存时间密切相关，异常表达者生存时间明显低于正常表达者。结果提示，p120ctn从细胞膜丢失转位至细胞质，除影响胰腺癌的侵袭和转移外，还影响患者的预后。

肿瘤的侵袭和转移除因细胞间黏附的破坏外，还有赖于新生血管的形成。Maniotis等［10］研究黑色素葡萄膜瘤时发现，恶性黑色素瘤细胞可环绕围成一种类似血管的可输送血液的管道样结构，即血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)，由拟态血管对其周围肿瘤细胞进行持续的血供。该研究显示，拟态血管阳性组较阴性组肝细胞癌(HCC)的E-cadherin的表达明显下降，这表明了E-cadherin与血管新生的密切关系。故p120ctn可能通过调节E-cadherin，从而调控血管的新生。除了实体瘤外，罗小华等［11］在骨髓增生异常综合征(MDS)研究中也发现，MDS组骨髓p120ctn的表达及MVD明显高于对照组。本实验结果表明，胰腺癌组织中MVD值要高于癌旁胰腺组织，提示p120ctn的异常表达除介导细胞间黏附的改变外，还可能影响肿瘤新生血管的形成。推测其原因，可能是p120ctn出现异常表达后，直接或间接导致E-cadherin的表达改变，并藉此影响胰腺癌的血管新生，但其确切的机制尚待进一步研究。

综上所述，本研究表明，与癌旁胰腺组织相比，p120ctn在胰腺癌中存在异常表达，其异常表达不仅与E-cadherin、CD34表达有关，且与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，并影响患者的预后。p120ctn可能在细胞间黏附和新生血管的形成两个方面介导胰腺癌的侵袭和转移，但其在胰腺癌发生、发展中所扮演的具体角色及分子机制还不甚清楚，有待进一步的研究。

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