玻璃化冷冻法对冻融胚胎移植周期结局的影响

娄 华，孙丽君，王兴玲，郝大勇，王雪梅，于晓娜

郑州大学第三附属医院生殖中心郑州450052

随着体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)技术的发展和广泛应用，胚胎冷冻技术已在人类辅助生殖领域占据了重要的地位。新鲜周期移植后剩余的可利用胚胎、为预防卵巢过度刺激综合征的发生以及促排卵过程中因内分泌或内膜异常而取消新鲜周期移植进行全胚冷冻，均对冷冻胚胎复苏后临床妊娠率和冷冻安全性提出了更高的要求。郑州大学第三附属医院生殖中心自2008年8月开展玻璃化冷冻技术冷冻人卵裂期胚胎，取得了较好的效果。该研究总结了470个复苏周期的临床结果，对玻璃化冷冻和传统的程序化慢速冷冻2种方法的复苏情况进行了比较。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2008年8月至2010年6月因不孕不育在郑州大学第三附属医院行IVF-ET或卵胞质内单精子注射术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的患者，于取卵后第3天对移植后剩余的可利用胚胎进行冷冻，所有患者均知情同意，并经医院伦理委员会讨论批准。共470个周期，其中玻璃化法冷冻胚胎324个周期(玻璃化组，共216例患者)，程序化慢速冷冻胚胎146个周期(程序化组，共92例患者)。

1.2 胚胎冷冻及复苏

1.2.1 冻存胚胎的选择 采用长方案或短方案促排卵，适时注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)，36～37 h后取卵，根据患者情况采用常规IVF或ICSI，取卵后第3天胚胎分级:Ⅰ级，细胞大小相对均匀，形状规则或碎片≤5%卵裂球面积;Ⅱ级，细胞大小稍不均匀，形态略不规则或5%≤碎片≤20%;Ⅲ级，细胞大小明显不均匀，形态明显不规则或20%≤碎片≤50%;Ⅳ级，停止发育，细胞大小严重不均或碎片＞50%。评分Ⅰ～Ⅲ级的胚胎为可利用胚胎。

1.2.2 冷冻及复苏方法 ①玻璃化冷冻法:应用Medicult玻璃化冷冻复苏试剂盒，试剂从冰箱内取出后室温下平衡20 min，将1～3个胚胎放入1 mL含较低浓度的乙二醇(EG)和丙二醇(PROH)平衡液中3～10 min，可看到胚胎先皱缩后恢复原状。将胚胎移入0.5 mL含较高浓度的EG和 PROH的冷冻保护液吹打不低于3次，用吸管将胚胎一次性放到冷冻载体(cryotop)上，迅速投入液氮并装麦管，在冷冻保护液中时间应不超过1 min。整个过程在室温下进行。复苏时将载体从液氮中取出，迅速置入平衡好的复苏液中1 min，将胚胎转移至稀释液1、稀释液2及稀释液3中各3 min后，再移至平衡液3 min，最后转移至培养液中清洗，置于37℃，体积分数6%CO2培养箱内。②程序化慢速冷冻法:室温下将胚胎转移至含体积分数5%甘油的冷冻液(1 mL)中平衡10 min，然后移至含体积分数9%甘油和0.2 mol/L蔗糖的冷冻液(1 mL)中平衡10 min后吸入麦管，每管1～3个胚胎，将麦管放入程序冷冻仪，以2℃/min的速率从25℃降温至-6℃，再浸泡10 min后以0.3℃/min的速率降温至-35℃后取出麦管浸入液氮。复苏时取出麦管，在空气中缓慢晃动30 s后，将麦管放入30℃水浴箱内30 s，取出麦管并剪断，将胚胎吹入含0.5 mol/L蔗糖的解冻液(1 mL)中10 min，再移至含0.2 mol/L蔗糖的解冻液(1 mL)中10 min，最后移入培养液中清洗，放入培养箱内培养。

解冻后的胚胎有3种情况:全部卵裂球完整，部分卵裂球完整，所有卵裂球损伤死亡。以解冻后胚胎存活的卵裂球数≥50%总细胞数作为胚胎复苏存活的标准。将解冻后存活的胚胎1～3个培养2 h后移植。

1.3 胚胎移植内膜准备方案及移植时机选择

1.3.1 自然周期 对月经规律、既往排卵正常的患者，月经第10天开始行B超监测卵泡发育，根据B超监测结合血黄体生成素(LH)、雌激素(E2)水平确定排卵时间，自排卵日给予黄体酮40 mg肌内注射，1次/d，排卵后2～3 d移植冻融胚胎。

1.3.2 激素替代周期 对于排卵不规律、月经不规则的患者，口服戊酸雌二醇递增或恒量法，当内膜厚度≥8 mm时，给予黄体酮40 mg肌内注射，1次/d，共2 d，黄体酮量加量至60 mg并维持该剂量。注射黄体酮3 d后移植胚胎。

1.4 妊娠诊断标准 胚胎移植后14 d监测血总HCG≥30 IU/L，为生化妊娠;胚胎移植35 d后B超提示妊娠囊或流产物中可见绒毛为临床妊娠。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析。2组患者年龄、不孕时间、移植日内膜厚度、胚胎分级、孕周、新生儿体质量及身高等的比较采用两独立样本的t检验，2组患者周期取消率、胚胎复苏率、胚胎完整率、临床妊娠率、胚胎种植率、流产率的比较采用χ2检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 2组患者一般情况比较 见表1。

表1 2组患者一般情况比较

2.2 2组患者胚胎复苏情况及妊娠情况比较 玻璃化组复苏324个周期，因胚胎死亡取消移植周期11个，共解冻877个胚胎，存活801个胚胎，移植793个胚胎;程序化组复苏146个周期，取消移植周期5个，共解冻427个胚胎，存活326个胚胎，移植313个胚胎。见表2。

表2 2组患者胚胎复苏情况及妊娠情况比较 %

2.3 2组患者分娩及新生儿情况比较 玻璃化组已分娩39例，其中双胎10例，单胎29例，共分娩新生儿49例;尚有65例处于继续妊娠中。程序化组已分娩30例，其中双胎2例，单胎28例，共分娩新生儿32例，其余4例仍在妊娠中。2组患者孕周、新生儿体质量及身高比较无差异，均未发现有遗传表型异常。见表3。

表3 2组患者分娩及新生儿情况比较

3 讨论

与新鲜胚胎相比，冷冻胚胎的临床妊娠率及胚胎种植率均较低，因为在胚胎冷冻过程中，可能会发生多种冷冻损伤，其中冰晶的形成是造成冷冻损伤的最主要因素。长期以来，人们一直应用程序化慢速冷冻技术进行人类胚胎的冷冻保存，程序冷冻采用缓慢降温的方式进行冷冻，降温的过程通常需要2 h。但较长的降温过程难以杜绝冰晶造成的冷冻损伤，虽然复苏后大部分胚胎可存活，但其完整性往往遭到破坏。1998年 Mukaida等［1］首次获得玻璃化冻融人类卵裂期胚胎妊娠及分娩成功。近年来，许多学者［2-3］相继开展了玻璃化冷冻卵母细胞、卵裂期胚胎及囊胚的研究，并取得了可喜的成绩。玻璃化冷冻是指在数分钟内将细胞固化为完全的玻璃态，可避免细胞内外冰晶形成对胚胎的机械性损伤，从而使胚胎复苏率及胚胎完整率明显提高。郑州大学第三附属医院生殖中心自2008年8月开展玻璃化冷冻人卵裂期胚胎后获得了较好的复苏效果。

研究结果显示:玻璃化组胚胎存活率、完整率及临床妊娠率均高于程序化组，与Rezazadeh等［4］研究结果一致。冻融后全部卵裂球存活表明胚胎有良好的发育潜力，部分卵裂球损伤或死亡可能会影响胚胎的孵出和植入。刘浩等［5］研究发现:卵裂球受损程度与妊娠率和胚胎种植率呈负相关，受损率越高，妊娠率和胚胎种植率越低。Rienzi等［6］主张移植前通过显微操作技术去除坏死卵裂球可显著提高冷冻胚胎的临床妊娠率及种植率，提示复苏胚胎中坏死的细胞可能影响存活细胞的发育，从而影响临床妊娠率。而玻璃化冷冻复苏胚胎完整率达83.24%，较高的胚胎完整率可能是其优于程序化慢速冷冻技术的关键。

尽管玻璃化冷冻技术在胚胎冷冻保存方面有以上诸多优势，但其冷冻人类胚胎、配子的历史毕竟仅十余年，其安全性一直受到关注。玻璃化冷冻需采用高浓度的冷冻保护剂，冷冻保护剂选择的核心问题在于尽可能降低对胚胎的毒性作用，又要考虑其形成玻璃化的能力。有学者［1］认为单独用一种冷冻保护剂EG的毒性最小，但常需较高的浓度。而联合应用PROH可弥补EG玻璃化形成能力差的问题，并降低其浓度。该研究使用的玻璃化冷冻保护液是商品化制品，主要成分是EG、PROH和蔗糖，采用低浓度的EG和PROH作为平衡液使胚胎有一定的冷冻保护剂负荷，缩短了胚胎在高浓度玻璃化冷冻液中的时间。为避免冷冻保护剂对胚胎的损伤及毒性作用，该研究采用的cryotop法冷却速率可达-23 000℃/min，在冷冻操作时严格控制玻璃化冷冻保护液与胚胎接触的总时间在60 s内。Cryotop载体属于开放式载体，使胚胎直接和液氮接触达到快速降温的目的，但具有潜在微生物污染的风险。为避免开放式载体可能引起的感染性疾病以及长期暴露在玻璃化冷冻液对胚胎的损伤，作者尝试开展采用封闭性载体进行玻璃化冷冻，因样本量少，尚需进一步研究。

该研究对玻璃化冷冻复苏后分娩的49例新生儿进行随访，均身体健康，无畸形儿出生。玻璃化组流产率与程序化组比较无差异，其孕周、新生儿出生体质量及身高均与程序化组无差异，与Wennerholm等［7］的研究结果一致。目前文献报道的最大样本是Takahashi等［8］对采用玻璃化冷冻复苏后分娩的252个新生儿进行随访的研究，尚未发现有遗传表型异常者，认为玻璃化冷冻保存胚胎是较安全的。但与程序化慢速冷冻已在临床上广泛应用二十余年、并有大量的随访数据提示其安全性的结果相比，玻璃化冷冻的产科和新生儿数据有限，还需今后深入研究对子代的影响。

［1］Mukaida T，Wada S，Takahashi K，et al.Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for 8-cell mouse embryos［J］.Hum Reprod，1998，13(10):2874

［2］Zhu D，Zhang J，Cao S，et al.Vitrified-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles:time for a new embryo transfer strategy［J］.Fertil Steril，2011，95(5):1691

［3］宋文妍，孙莹璞，金海霞，等.睾丸取精失败周期中冷冻卵子与新鲜卵子妊娠结局的比较［J］.郑州大学学报:医学版，2010，45(4):651

［4］Rezazadeh VM，Eftekhari P，Karimian L，et al.Vitrification versus slow freezing gives excellent survival，post warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos［J］.J Assist Reprod Genet，2009，26(6):347

［5］刘浩，金志魁，耿春惠，等.卵裂球受损对冻融胚胎移植周期临床结局的影响［J］.生殖医学杂志，2007，16(1):12

［6］Rienzi L，Ubaldi F，Iacobelli M，et al.Developmental potential of fully intact and partially damaged cryopreserved embryos after laser-assisted removal of necrotic blastomeres and post-thaw culture selection［J］.Fertil Steril，2005，84(4):888

［7］Wennerholm UB，Söderström-Anttile V，Bergh C，et al.Children born after cryopreservation of embryos or oocytes:a systematic review of outcome data［J］.Hum Reprod，2009，24(9):2158

［8］Takahashi K，Mukaida T，Goto T，et al.Perinatal outcome of blastocyst transfer with vitrification using cryoloop:a 4-year follow-up study［J］.Fertil Steril，2005，84(1):88