基于液质联用技术艾滋病病毒携带者、艾滋病患者脾肺气虚证者尿液的代谢组学研究

谢世平 马素娜 刘伟 陈玉龙 崔永霞 许前磊 张宁 王娟 温冠晓

代谢组学是继基因组学、蛋白组学之后发展起来的一门新组学，已广泛应用于医学领域，它通过运用现代仪器检测分析手段，定性或定量研究观察生物样本中所有可检测的代谢产物的综合表现，探讨生物体对外源性物质以及遗传变异的应答等所引起的病理生理变化反应，将这些变化反应与代谢信息中的生物学相关事件联系起来，以检测活细胞中的化学变化及其生物学意义［1］。由于其具有与中医学整体观、即时性相一致的特点，将成为生命科学研究者研究中医“证”本质的有力工具［2］。通过运用代谢组学的研究方法，寻找艾滋病患者尿液中的特异代谢产物，为中医药在诊断和防治艾滋病进展中的作用提供先进的技术支持。

1 对象与方法

1.1 对象

共纳入研究对象20例，均为汉族，农民。其中疾病观察组12例均为来源于河南省某地区的艾滋病病毒携带者、艾滋病患者(HIV/AIDS)脾肺气虚证者。健康对照组8例，均为当地健康人。疾病观察组:男6例(50%)、女6例(50%);年龄31～40岁1例(8.3%)、41～50岁 6例(50%)、51～60岁 5例(41.7%);已婚9例(75%)、离异1例(8.3%)、丧偶2例(16.7%)。健康对照组:男4例(50%)、女4例(50%);20～30岁1例(12.5%)、31～40岁1例(12.5%)、41～50岁3例(37.5%)、51～60岁3例(37.5%);已婚7例(87.5%)、未婚 1例(12.5%)。经统计学分析两组对象一般资料差异无显著性。

1.2 诊断标准

西医诊断标准采用国家卫生部2005年推荐《艾滋病诊疗指南》诊断标准:有流行病学史、实验室检查HIV抗体阳性。

中医辨证标准:以课题组前期对HIV/AIDS患者大样本中医证候学的临床调查的研究成果为基础［国家自然科学基金项目(90409004):艾滋病中医证候分布规律及证候标准建立与验证］，拟定艾滋病中医常见基本证候辨证标准中脾肺气虚证的诊断标准。中医证候脾肺气虚证相关的症状和体征:动则气喘、易感冒、咳痰清稀、咳声低微、自汗、神疲乏力、恶风寒、心慌心悸、胸闷、泄泻、便溏、舌体胖大、舌质淡或淡白、舌苔薄白、脉象虚或细弱等。

1.3 纳入标准

疾病观察组的纳入标准:(1)HIV确认试验阳性;(2)符合《HIV/AIDS常见中医证候诊断量表》中脾肺气虚证诊断标准，中医辨证须经两名副主任中医师以上职称医生诊断一致;(3)年龄在18～60岁;(4)签署知情同意书。

健康对照组的纳入标准:(1)HIV抗体阴性;(2)身体健康无脏器严重疾病或慢性病急性发作者;(3)无神志不清、痴呆、各种精神病患者;(4)非妊娠或哺乳期妇女;(5)年龄在18～60岁之间;(6)能配合调查并签署知情同意书。

1.4 排除标准

(1)不符合以上纳入标准者;(2)非因感染艾滋病所患的脏器严重疾病，原发性免疫缺陷，激素化疗等引起的继发性免疫缺陷，血液病，其它原因引起的中枢神经系统疾病。

1.5 仪器及试剂

主要仪器设备:LCQ Advantage MAX电喷雾离子阱液质联用仪(美国赛默飞世尔科技公司);色谱柱(Agilent Zorbax C18)(150 ×2.1mm，3.1μm);高速冷冻离心机(Jouan MR23i)(法国Jouan公司);低温冰箱(MDF5411)(日本三洋株式会社);超纯水器(MiII-QSyntheSiS)(美国MiIIPore公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

主要试剂:乙腈(色谱纯级，购自Merck公司);甲酸 (HPLC/SPECTRO级，购自Tedia公司);甲醇(色谱纯级，购自 Merck公司);高纯氮气(纯度＞99.99%);高纯氦气(纯度＞99.99%)。

1.6 尿液样品的预处理

用EP管收集正常对照组、脾肺气虚证组和湿热内蕴证组研究对象的晨尿2 ml，移取1 ml尿液，4000转/分高速离心10分钟，取上清液。精密移取上清液 300 μl，置 1.5 ml离心管中，加入 600 μl甲醇，用混匀器混匀约10分钟，然后高速离心10分钟，14000 转/分，4 ℃ 控温，取上清液 800 μl，用0.45 μm滤膜过滤，即得供试品溶液，低温冰箱保存。

1.7 液相色谱—质谱条件

(1)液相色谱条件:色谱柱为Agilent Zorbax C18(150×2.1 mm，3.1 μm);流动相:0.2%冰醋酸水—甲醇梯度洗脱(见表1);流速:0.2 ml/min;进样盘温度:4℃;进样量:20 μl;柱温:30℃;色谱图采集时间不少于60分钟。(2)质谱条件:扫描方式:一级全扫描;鞘气流速:4000 kpa;辅助气流速:1000 kpa;喷雾电压:4 kV;毛细管电压:-4 V;毛细管温度:300℃，质荷比范围:80～1000，采用负离子扫描模式。

1.8 液质联用分析方法学考察

(1)空白溶剂考察:取供试品制备所用甲醇—水(2∶1)，按照梯度洗脱条件进样，考察空白溶剂产生的干扰，对数据进行分析时，扣除空白溶剂的干扰。(2)精密度试验考察:取供试品溶液(如正常对照组10号样本)，重复进样6次，以总离子流图中各色谱峰的保留时间和峰面积为指标，考察仪器的精密度，多次测量样本相对标准偏差RSD% ＜3%。(3)重复性试验考察:取同一患者的尿液，分别制样6份，行色谱分析，以总离子流图中各色谱峰的保留时间和峰面积为指标，考察方法的重复性，RSD% ＜3%;(4)稳定性试验考察:取供试品溶液(如健康对照组10 号样本)，分别于 0、1、2、4、8、12 小时稳定电压行色谱分析，以总离子流图中各色谱峰的保留时间和峰面积为指标，考察样品稳定性，RSD% ＜3%。

表1 液相色谱法冰醋酸水—甲醇洗脱梯度表

1.9 数据分析

(1)经质谱分析仪器自带软件导出原始数据(质荷比对应的峰强度)Excel文件，对数据进行筛选，筛选原则为:每个证型中相同质荷比(数据上下浮动在±1的定义为同一类物质)。(2)对所筛选出的差异结果通过SPSS 13.0软件进行t检验分析，P＜0.05有统计学意义。根据P值、各组间相同质荷比均数(同一质荷比对应的不同分组中所有样本峰强度的均数)的比值(以1.5倍原则)进行筛选，筛选出差异物质，通过比较两组间相应代谢产物的峰值明确其变化的趋势(增多或减少)。(3)对其中有显著差异的数据采用PCA模式识别分析。

2 结果

2.1 方法学考察

空白溶剂考察结果显示试剂无干扰;精密度考察、重复性和稳定性考察结果表明仪器精密度良好、方法的重复性和稳定性良好。

2.2 指纹图谱(见图1～2)

2.3 t检验分析

从图3可以看出在HIV/AIDS脾肺气虚证组中质荷比分别为 794、618、339、502、118、384 的 6 种物质与正常组相比峰强度均减小，且相差大于1.5倍。质荷比为 412、413、368、229、286、287、325、327、529、299、210、347、311、329、331、303、345、523、505、295、300、213、521、507、293、365 的 26 种物质在HIV/AIDS脾肺气虚证组峰强度明显的高于健康对照组，相差远大于1.5倍。两组物质经t检验均P＜0.05，差异有明显性。其中质荷比为412、505、794、118、329、331 的 6 种物质，在两组中峰度均较高且两组差异明显。可能为两组间的特异性物质。

2.4 PCA分析结果

数据用正交信号校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)后进行偏最小二乘模式识别(Partial Least Squares-discriminant analysis，PLS-DA)分析。从变量散点图(plot)中可发现显著差异的变量，即为“生物标志物”。

从图4中可以看出:健康对照组(■所示)和HIV/AIDS脾肺气虚证组(◆所示)两组间能明显的区分开，两组之间存在显著的差异。

从图5中可以看出在分子量为352、388、618、562、502、159、560、384、794、109、101、118、117、125、339的离子物与其他离子相距较远，可以认为是艾滋病病人脾肺气虚证组相对于健康对照组的潜在标志物。

从图6中可以看到:第一主成分:R2Y=0.59，Q2=0.51;第二主成分:R2Y=0.86，Q2=0.75，这说明:第一主成分代表了整体信息的程度为59%左右，预测率为51%左右;第二主成分可以代表整体样本信息的程度为27%左右，预测率为24%左右。前两个主成分对整体样本信息的覆盖程度为80%，整体预测率为75%。这可以认为是一个很理想的模型，它对大部分的数据(主成分)都能进行解释，且预测率较高，预测能力强，结果意义可信。

3 讨论

图5 健康对照组与脾肺气虚组PLOT图

中医药认识疾病的方法、理论均缺乏合适的现代科学表达体系，目前仍是一种不能与现代医学相兼容、相通的“语言”。要进一步实现中医药的现代化和国际化，其根本在于用现代科学语言阐释中医独特的理论体系。代谢组学通过获取体内动态变化的综合信息了解人体可能受影响的部位和环节，这与传统中医学“思外揣内”的诊治方法具有内在的同一性，代谢组学是一种较全面的系统的研究技术，在方法学上具有融整体、动态、综合、分析于一体的特点，采用代谢组学这种现代医学承认的尖端技术可以克服中医传统方法的局限，成为适合现代中医药研究的重要技术手段，成为沟通中医和现代医学的桥梁。而且无论是中医的“证”还是代谢组学，研究的都是致病因素作用于人体后机体某一阶段反映的病理性变化的综合情况，二者皆从机体整体变化的角度进行评价分析，共同体现了即时性、整体性的特点。中医“证”是辨证论治的起点和核心，应用代谢组学技术可以分析中医证候的特异性代谢产物或标志物，进而促进中医证候的客观化和证本质的研究，为中医证候诊断的量化、客观化和标准化提供方法和依据［3］。

本研究运用液质联用技术与主成分分析方法相结合来研究HIV/AIDS脾肺气虚证患者与健康对照研究对象的尿液代谢轮廓的差异，结果显示该方法能够将两组间的尿液代谢轮廓进行良好的区分(PLS-DA图)，HIV/AIDS脾肺气虚证患者组相对与健康对照组存在着显著的差异物质或物质群(PLOT图)。基于液质联用技术结合PCA模式识别的代谢组学的研究方法是一种可以用于研究机体复杂病理生理变化的先进的技术方法，或许可以成为揭示中医证候本质研究的强有力的工具。

本次研究通过探索HIV/AIDS脾肺气虚证的代谢物质的差异，尝试为中医药在诊断和防治艾滋病进展中的作用研究提供崭新的思路，尝试为中医证本质研究，更为临床多种疾病的诊断和防治提供新的思路和方法。

［1］Nicholson JK，Connelly J，Lindon JC，et al.Metabonomics:a platform for studying drug toxicity and gene function［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1(2):153-161.

［2］徐舒，陈合兵，李洪，等.“肝郁证”大鼠模型的建立及代谢组学的初步研究［J］.中华中医药杂志，2009，24(6):787-791.

［3］温淑云，郦永平.中医证候量化分析研究述略［J］.实用中医内科杂志，2007，21(5):5-6.