艾灸对类风湿关节炎模型大鼠跖关节中细胞因子的影响

罗磊 胡玲 宋小鸽 唐照亮 何璐 蔡荣林 郝峰

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性、自身免疫性疾病。据报道，中国的RA患病率0.32% ～0.36%左右［1］。历代中医典籍中虽没有记载类风湿关节炎这个病名，但依据其疼痛遍历肢节等临床症状而言，当属中医学“痹病”、“历节”、“痛风”等范畴。局部关节疼痛为类风湿关节炎的主要症状。本课题组前期研究表明，艾灸能显著改善类风湿关节炎模型大鼠局部和全身症状，减轻关节肿胀，提高大鼠进食、进水量，并能有效调节大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)含量，改善神经免疫调节机制，纠正炎症时自由基代谢紊乱，诱导滑膜炎症细胞凋亡、改善局部关节滑膜细胞超微结构［2-8］。本研究以RA模型大鼠局部跖关节中细胞因子为研究对象，进一步揭示艾灸的局部抗炎免疫机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

Wistar大鼠，由南京医科大学实验动物中心提供［合格证号:SCXK(苏)2008-0004］，清洁级，雄性，月龄3～4月，体重180～220 g，120只。

大鼠适应性喂养一周后，按照《卫生统计学》随机数字表［9］随机抽取20只为正常组，放于室温18～20℃动物房内常规喂养，正常饮水进食。其余大鼠进行模型复制，模型复制成功后，随机分为模型组、药物组、针刺组、艾灸组、CO2激光组，每组20只。模型组不做任何处理，其余各组分别给予相应治疗。整个实验过程均按照实验动物伦理学的规定进行。

1.2 主要试剂及仪器

特制香烟型纯艾条(Φ=5 mm，南阳市卧龙汉医艾绒厂，061205);汉医针灸针(天津杏林书院医疗器械有限公司，040601);雷公藤多甙片(上海复旦复华药业有限公司，070402);弗氏完全佐剂(美国SIGMA公司，10 ml，068K8761);IL-1免疫组化试剂盒(北京博奥森，908267W);IL-2免疫组化试剂盒(北京博奥森，906234H);TNF免疫组化试剂盒(北京博奥森，862471K)。

自制铝合金、玻璃造模箱:1.2 m×1.0 m×0.8 m(1 m×0.6 m×0.5 m);CO2激光治疗仪(ML015-CA，上海万奇光电技术有限公司);高效荧光显微镜(Olympus，BX51);数码照相装置(Olympus，DP70)。

1.3 模型复制

采用风、寒、湿环境因素加生物因子复合造模方法［4］，复制RA模型大鼠。将大鼠放置在可控制温度、湿度的自制造模箱内，使箱内温度控制在(6±2)℃，湿度80% ～90%。所有需要造模的大鼠均放入上述造模箱中20天(12小时/天)(20∶00-8∶00)。第21天给大鼠足跖部注射完全弗氏佐剂0.15 ml/只，建立RA大鼠模型。观察3天，以24小时出现足踝部急性炎症肿胀，48小时出现继发性全身多发性关节炎，表现为前肢或对侧肢体甚至耳、尾部红肿或炎性结节出现，示模型复制成功。

1.4 取穴与治疗方法

参照文献［2-7］，选取“足三里”和“肾俞”穴，根据“大鼠穴位图谱”，分别作穴区定位，剪去各穴区被毛，标记颜色。致炎造模3天后，艾灸组用特制香烟型纯艾条距穴2 cm处悬灸;CO2激光组应用10.6 μm CO2激光治疗仪进行穴位照射，输出端距穴2 cm，激光光斑直径为2 mm;针刺组用1寸毫针(25 mm)于穴区消毒后快速进针，针刺深度参考《实验针灸学》。各组治疗时，“肾俞”、“足三里”二穴交替使用，每天一穴(双侧)，每天1次，每次20分钟，连续治疗15天;药物组进行雷公藤溶液灌胃给药，浓度为 1.6 mg/ml，剂量按 8 mg/(kg·d)，即每100 g大鼠灌胃0.5 ml，每天1次，共灌药15天，平均总量为 24 mg/只，计 15 ml［10］。正常组和模型组大鼠不作任何治疗处理。

1.5 取材方法

实验第39天，用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠仰位固定，取大鼠右足跖关节。脱钙固定，待测，检测方法参照免疫组化试剂盒说明。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠行为观察

正常组大鼠皮毛光泽，色白，精神佳，活动自如，反应灵敏，饮食正常。致炎造模后，可观察到模型组大鼠皮毛黯淡发黄、纠结无光泽，尾部出现数量不一、程度不等的结节，部分大鼠爬行困难，病变累及未注射弗氏完全佐剂(FCA)的足爪，纳食减少，大便稀软，脱毛情况较严重。然而，其它各治疗组大鼠的毛发、进食饮水量，活动度等方面均可观察到不同程度的改善。

2.2 跖关节中细胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α 的测定结果

模型组大鼠跖关节中IL-1β、TNF-α的平均光密度和灰度与正常组比较显著性增高(P＜0.01，或P＜0.05)，IL-2的平均光密度和灰度显著性降低(P＜0.01)，说明模型组大鼠局部跖关节中细胞免疫紊乱，Th1/Th2失去平衡，炎性反应明显。经15天治疗后，艾灸组、针刺组及CO2激光组均能下调类风湿关节炎大鼠跖关节中IL-1β、TNF-α的平均光密度和灰度，上调IL-2的平均光密度和灰度，与模型组比较差异性显著(P＜0.01或P＜0.05)，与雷公藤多甙药物组比较无显著性差异(P＞0.05)，说明艾灸、针刺及CO2激光穴位照射具有降低局部跖关节中促炎症细胞因子IL-1β和TNF-α，提高T细胞生长因子IL-2的效应，良性调整Th1/Th2平衡，纠正细胞免疫紊乱，与雷公藤多甙治疗效果相当。见表1和图1～2。

3 讨论

艾灸疗法起源于中国，源远流长，是针灸医学的重要组成部分，也是中医防病治病的一个重要手段。灸法可治寒、热、虚、实诸证，对百余种病症有很好的疗效，具有广泛的适应证，其独特的诊疗方法、显著的疗效和丰富的文献资料是人类传统医学的宝贵财富。灸法治疗类风湿关节炎，是中国传统医学的特色之一，在国际上独树一帜。《千金方》载:“历节风痛，但痛处灸二七壮，佳。”《扁鹊心书》:“于痛处灸五十壮自愈。”课题组前期研究已证实，艾灸对RA大鼠有明显的镇痛、抗炎、消肿作用，灸治“肾俞”、“足三里”穴不仅能抑制血清中 TNF、IL-1等炎症因子的释放，改善与增强机体的免疫功能，纠正炎症时自由基代谢的紊乱，而且亦存在诱导滑膜炎症细胞的凋亡、改善滑膜细胞超微结构等多方面作用［2-8］。

细胞因子是一类由免疫细胞和相关细胞经刺激而分泌的具有高活性、多功能的小分子蛋白质的统称。在很多情况下，多种免疫细胞间的相互作用是通过细胞因子介导的，细胞因子通过作用于靶细胞的特异受体而表现其活性［11］。根据细胞因子的传统名称和生物学特性可以分为:白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、生长因子(GF)、趋化性细胞因子等。大量研究发现艾灸足三里、肾俞、关元穴能明显升高血清中IL-2的水平，降低血清IL-1、IL-6、TNF、一氧化氮(NO)的水平，从而在一定程度上增强和改善机体的免疫机能，纠正机体免疫紊乱［12，13］。

表1 不同组别大鼠IL-1、IL-2、TNF-α 比较(±s，n=20)

表1 不同组别大鼠IL-1、IL-2、TNF-α 比较(±s，n=20)

注:与模型组比较，aP ＜0.05，bP ＜0.01;与正常组比较，cP ＜0.05，dP ＜0.01;与艾灸组比较，eP＜0.05。

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通过文献检索发现，在探讨艾灸治疗类风湿关节炎的作用机制过程中，多数集中在对模型大鼠血清中细胞因子的观察，较少见对类风湿关节炎局部病变影响的报道。本实验研究发现，模型组大鼠跖关节中促炎症细胞因子IL-1、TNF含量显著增高，生长因子IL-2水平显著降低，与正常组比较差异较大;而且各治疗组均能不同程度的下调跖关节中的IL-1、TNF含量，上调IL-2含量。这一结果与大鼠行为学的改善相类似。表明艾灸对局部关节组织中细胞因子的紊乱具有良性调节作用。结合前期基础发现，艾灸不仅能够调节全身血清中细胞因子紊乱，而且对局部关节组织中的细胞因子亦存在调整作用。这一结果表明，艾灸对局部关节组织中细胞因子的调节亦是其抗炎免疫机制之一。然而大多数研究主要集中在促炎因子如IL-1、TNF等细胞因子的研究上，其他细胞因子也可能参与了艾灸免疫调节作用，如IL-4、IL-10、IL-13等抑炎因子的参与。因此，从促炎因子和抑炎因子两个方面，即从Th1/Th2平衡调节方面，并以全身血液和局部关节为研究载体观察艾灸抗炎免疫机制，还有待于进一步研究。

通过研究结果发现，艾灸组、针刺组与药物雷公藤多甙组具有相似的效应，均能不同程度的改善局部关节中细胞因子的紊乱，提示艾灸疗法与针刺疗法同样存在抗炎免疫的作用，其对IL-1、IL-2、TNF的影响可能是共同的抗炎免疫机制，至于艾灸与针刺间是否存在特异性抗炎免疫机制，仍待进一步探讨。

本实验所采用的ML015-CA型10.6 μm CO2激光治疗仪为模拟艾灸效应的新型激光治疗仪。而波长为10.6 μm的CO2激光，能在表皮0.2 mm内被吸收，使皮肤表面温度明显提高，其热效应较为持久［14］，且具有模拟艾灸的效应［15，16］。同时，本实验结果发现波长为10.6 μm的CO2激光亦存在下调IL-1、TNF水平，上调IL-2水平的作用，与艾灸抗炎免疫效应相似。因此，艾灸在治疗RA过程中所产生的红外光谱可能是艾灸发挥抗炎免疫效应的机制之一。但是CO2激光穴位照射的效应是否可与艾灸的效应等同;其他波长的CO2激光或其他激光照射是否具有类似的作用;艾灸治疗过程中的温热刺激是否存在一定作用;艾叶本身的有效成分——艾油等作用于局部穴位后是否亦存在类似的效应，仍需进一步深入探讨，为探明艾灸发挥治疗效应的作用原理及其内在机制提供准确而全面的依据。

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