冬虫夏草对DN大鼠肾足细胞的保护作用观察

潘梦舒，郝 丽，郑 云，丁 楠

(安徽医科大学第二附属医院，合肥230601)

有研究表明［1］，DN无论临床表现为微量蛋白尿还是大量蛋白尿，均伴有足细胞数目及密度减少、足细胞的宽度增加;且足细胞数目及密度减少与尿蛋白呈负相关，足细胞减少严重者肾小球硬化及血清肌酐水平升高的发生率均明显增高。足细胞及其裂孔膜蛋白Nephrin和Podocin在肾脏正常生理功能以及DN的发生发展中起重要作用［2～6］。多项研究结果表明［7，8］，冬虫夏草(CS)及其制剂通过降血糖、血压和调节血脂、减少肾细胞凋亡、拮抗肾组织纤维化等机制对发挥治疗DN的作用，但其保护肾脏的机制是否与其改善DN足细胞病变有关，目前尚无确切资料证实。2009年，我们通过建立DN大鼠模型，观察CS对DN大鼠肾足细胞的保护作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 雄性SD大鼠60只，18～20周龄，重180～200 g。人工CS菌粉(江西济民有限制药公司提供)。链尿佐菌素(STZ)，临用前溶解在0.01 M枸橼酸缓冲液中，pH 4.5。兔抗大鼠Nephrin单克隆抗体、兔抗大鼠Podocin多克隆抗体。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及建模 所有动物适应性喂养1周后随机分为3组，各20只。A组为正常对照组，B组为DN模型组;C组为CS干预组。B、C组根据中外文献结合预实验，选择一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，以随机血糖为≥16.7 mmol/L，尿糖 +++～++++视为糖尿病模型制作成功，4周后监测24 h，尿蛋白定量在30 mg/24 h以上者，表示DN模型成功［9］。

1.2.2 给药方法 DN模型成功后入组干预。C组给予CS菌粉5 g/(kg·d)灌胃(水泡后温火熬成浓度为2 g/ml)。A、B组给予等量饮用水灌胃，1次/d。每周称重调整用药剂量，连续给药8周。所有大鼠在实验期间标准饮食，自由饮水，不用胰岛素。

1.2.3 观察指标及方法 ①24 h尿白蛋白排泄量(UAER)测定:实验结束前1 d留取大鼠24 h尿液，离心后保存于－80℃冰箱中，根据试剂盒说明书测定UAER。②肾小球、肾小管形态学检查:大鼠处死前称重，在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右侧颈总动脉插管注入4℃预冷NS，反复灌洗肾脏后游离。经肾门冠状面切取厚约2 mm的标本，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，厚2 μm切片，行HE染色，光镜下观察肾小球、肾小管改变。③足细胞形态学检查:取1 mm3的肾组织，戊二醇固定，行透射电镜检查，观察足细胞变化。④肾组织中Nephrin和Podocin染色方法:取8 mm3的肾组织，4%多聚甲醛固定，厚3 μm切片，行免疫荧光染色，观察Nephrin和Podocin分布并拍照。采用JD-801D计算机图像分析系统计算各组肾小球内Nephrin和Podocin的平均光密度。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.0软件包进行统计分析。所有数据以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组24 h UAER比较 A、B、C组24 h UAER分别为(36.92±3.48)、(108.06±15.73)、(65.40±8.95)mg/24 h，B 组 ＞C 组 ＞A 组(P 均 ＜0.01)。

2.2 各组肾组织病理改变 HE染色结果:A组为正常肾组织;B组肾小球肥大，肾小管变形;C组上述病理改变(肾小球肥大，肾小管变形)明显减轻。

2.3 各组足细胞形态学变化 A组足细胞未见病理改变;B组足细胞足突融合，足突裂孔数减少、裂孔膜消失;C组足细胞损伤较B组明显减轻，足细胞形态基本恢复正常。

2.4 各组肾组织中Nephrin和Podocin蛋白分布情况 见表1。免疫荧光图片及半定量分析显示足细胞裂孔蛋白Nephrin和Podocin在A组沿肾小球毛细血管袢呈均匀连续的线状分布;B组为弥散的颗粒状分布，Nephrin和Podocin蛋白表达明显减少(P＜0.01);C组与B组比较Nephrin和Podocin蛋白表达有明显增加(P＜0.01)，表现为连续的线状分布。

表1 各组肾组织中Nephrin和Podocin蛋白光密度比较(±s)

表1 各组肾组织中Nephrin和Podocin蛋白光密度比较(±s)

注:与A组比较，*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01;与 B 组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别 Nephine蛋白 Podocin 蛋白A组0.215±0.001 0.216±0.001 B 组 0.728±0.222＊＊ 0.773±0.231＊＊C 组 0.468±0.021＊△△ 0.477±0.019＊△△

3 讨论

CS为麦角菌科真菌，富含氨基酸、多糖、有机酸、多种微量元素、核苷酸、肽类及甾醇类等成分［10，11］，可通过多靶点、多环节机制，发挥减少尿蛋白、改善肾功能及减轻肾脏病理改变等作用［7，8，12］。

DN为糖尿病主要的微血管并发症，其主要表现为尿蛋白排泄率增加、肾功能的进行性减退直至发展为终末期肾病。蛋白尿不仅是DN肾小球损伤的标志，而且是加速肾脏损害的重要原因。在本实验中，我们发现CS可减少DN大鼠24 h UAER，减轻肾脏损害。

DN的发生与足细胞损伤有关［2～6］。足细胞是一组高度分化和特异化的细胞，通过稀疏的足突附着于肾小球基底膜，具有防止蛋白漏出、维持肾小球毛细血管袢完整性、对抗肾小球毛细血管内流体压力和维持肾小球基底膜结构成分更新等功能。有研究表明［13，14］，DN 早期足细胞数目和密度已开始减少，随病变加重而加重，足细胞病变不仅导致大量蛋白尿发生，且与K-W结节形成、肾小球硬化和肾功能损伤有关。足细胞相邻足突间裂隙由裂孔隔膜连接，该膜上分布多种蛋白，主要包括Nphrin、Podocin蛋白等，又称裂孔膜蛋白。近年研究发现，DN大鼠随着肾脏损害的进展，其Nephrin蛋白的表达显著降低，且与UAER增加有关。且发现DN时Nephrin呈颗粒状分布，而在正常肾组织中呈斑点和(或)线状分布。

我们发现，DN模型大鼠经CS治疗12周后，24 h UAER显著减少，肾小球肥大、肾小管变形明显减轻，足细胞的足突融合、裂孔隔膜消失、裂孔数目减少等病变明显改善，Nephrin和Podocin表达明显增加，提示CS具有保护DN大鼠足细胞的作用，其机制可能与其上调Nephrin和Podocin蛋白的表达有关。

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