肝癌耐药细胞中MDR1 mRNA、P-糖蛋白的表达变化及意义

段 睿，张 浩

(荆门市第一人民医院，湖北荆门448000)

化疗是中晚期肝癌的主要治疗手段，但治疗效果不理想，与肿瘤的多药耐药(MDR)密切相关。研究显示，肝癌细胞中MDR1基因的扩增及其产物P-糖蛋白的过度表达，是导致化疗失败的重要原因。2009年5月～2010年11月，我们用不同浓度盐酸阿霉素(Adr)诱导肝癌耐药细胞株HepG2(HepG2 Adr)，观察HepG2、HepG2 Adr细胞中 MDR1基因、P-糖蛋白表达的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 肝癌 HepG2细胞，RPMI1640，胎牛血清，Adr;RT-PCR两步法试剂盒，免疫组化SP试剂盒，兔抗人P-糖蛋白单克隆抗体，引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 耐药肝癌细胞株的建立 采用药物浓度递增法，诱导产生对 Adr具有稳定耐药性的HepG2Adr，Adr浓度梯度为 0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L，在含20%FCS的RPMI1640培养液中传代培养。

1.2.2 HepG2、HepG2 Adr细胞中 MDR1 mRNA 检测方法 取对数生长期的HepG2及不同Adr浓度梯度下的HepG2 Adr细胞，按RT-PCR两步法试剂盒说明操作。以β-actin作为内参照，以其比值作为MDR1 mRNA表达量。其中β-actin上游引物为5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，下游引物为5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'，片段大小为303 bp;MDR1上游引物为5'-CCATCATTGCAATAGCAGG-3'，下游引物为 5'-AGTCCTCGTCTTCAAACTTG-3'，片段大小为157 bp。

1.2.3 HepG2、HepG2 Adr细胞中 P-糖蛋白检测方法 采用免疫组化SP法。取对数生长期的HepG2及不同Adr浓度梯度下的HepG2 Adr细胞，细胞爬片后经多聚甲醛固定，加入1∶400兔抗人P-糖蛋白单克隆抗体，按剂盒说明染色。P-糖蛋白阳性细胞为肿瘤细胞膜和(或)细胞质出现棕黄色颗粒。每组随机观察10个高倍视野，计算P-糖蛋白阳性细胞所占百分比，以此表示P-糖蛋白表达量。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。数据以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

HepG2、HepG2 Adr细胞中 MDR1 mRNA、P-糖蛋白表达比较，见表1。由表1可见，肝癌HepG2 Adr细胞与 HepG2细胞中 MDR1 mRNA、P-糖蛋白表达量比较，P均＜0.05;且随着肝癌HepG2 Adr细胞耐药性增高，MDR1 mRNA、P-糖蛋白表达量逐渐增高(P 均 ＜0.05)。

3 讨论

MDR是指抗某种细胞毒物的耐药细胞系对许多结构上无关、作用机制不同的其他抗癌药物产生交叉抗药性［1］，是化疗失败最常见原因之一。目前，研究显示肝癌MDR的分子机制包括:① MDR1途径;②多药耐药相关基因(MRP)和肺癌多药耐药基因(LRP)途径;③抗细胞凋亡信号增强途径;④谷胱甘肽酶系统激活途径;⑤改变DNA拓扑异构酶途径;⑥乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)介导途径［2］。由此可见，肝癌MDR是多因素、多水平、多基因参与的一个极其复杂过程。

表1 HepG2、HepG2 Adr细胞中 MDR1 mRNA、P-糖蛋白表达量比较(± s)

表1 HepG2、HepG2 Adr细胞中 MDR1 mRNA、P-糖蛋白表达量比较(± s)

肝癌细胞类型 MDR1 mRNA P-糖蛋白(%)HepG2 0.18±0.08 5.73± 0.52 HepG2 Adr 0.01 μmol/L Adr 0.26±0.11 15.44± 4.55 0.10 μmol/L Adr 0.56±0.17 26.76± 5.23 1.00 μmol/L Adr 10.78±0.20 64.21±14.22 10.00 μmol/L Adr 1.21±0.17 90.23± 7.68

目前，研究最多且得到大家广泛认可的是MDR1途径。与P糖蛋白有关的基因有3种，即MDR1、MDR2和 MDR3，其中 MDR1基因与肿瘤细胞耐药性有关［3］。由MDR1编码并翻译的P-糖蛋白，是具有三磷酸腺苷(ATP)结合域的跨膜转运蛋白超家族成员。当其与化疗药物结合后，可依靠ATP提供的能量将多种结构和作用机制不同的化疗药物排出肿瘤细胞外，导致细胞内化疗药物浓度明显下降，从而阻碍化疗药物在细胞内发挥作用，不能有效杀伤肿瘤细胞而产生肿瘤细胞耐药现象［4，5］。本研究以人肝癌细胞为研究对象，在体外经Adr多次筛选、传代建立肝癌细胞耐药模型HepG2 Adr，研究肝癌耐药细胞MDR1 mRNA和P-糖蛋白的变化。结果表明，肝癌耐药细胞HepG2 Adr的MDR1 mRNA和P-糖蛋白表达明显增加，且其表达量与肿瘤细胞耐药的程度呈正相关。这说明MDR1 mRNA及P-糖蛋白升高是肝癌MDR产生的重要途径，其可将肝癌细胞内化疗药物泵出胞外，使细胞内药量降低而无法有效杀灭肿瘤细胞。因此，在临床诊治过程中，我们可以通过对肝癌组织或细胞进行MDR1 mRNA及P-糖蛋白检测，对于高表达者尽量避免使用属于MDR的药物或采用其他治疗方法，进行个体化治疗，以获得更好的治疗效果。

［1］魏若晶，贾宁，杨文增，等.膀胱癌组织中 MDR基因产物 PGP170的表达及意义［J］.军医进修学院学报，2009，2(30):41.

［2］蒋明东，李少林.肝癌MDR产生途径与逆转研究进展［J］.天津医药，2006，5(34):353-354.

［3］徐彬.卵巢上皮性癌中GST-π、TopoⅡβ、MDR1的表达及其与化疗疗效的关系［J］.现代实用医学，2011，2(23)128-133.

［4］Salvesen GS，Duckelt CS.IAP proteins:Blocking the road to death＇s door［J］.Nal Rev Mol Cell Biol，2002，3(6):401-410.

［5］惠廷平，黄高升.膀胱移行细胞癌P-gp 170表达与细胞凋亡的关系［J］.第四军医大学学报，2002，23(10):947-949.