奥沙利铂联合rmhTNF对胃癌BGC-823细胞凋亡的影响

马 宁，徐化恩

(1河南省人民医院，郑州454000;2郑州人民医院)

细胞毒性化疗药物在晚期胃癌的治疗中占有重要地位，化疗药物除具有杀死肿瘤细胞功能外，还有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)能在杀灭肿瘤细胞的某些环节与化疗药物起协同或加强作用，从而起化疗增敏作用。2009年6月～2010年12月，我们观察了奥沙利铂(OXA)联合rmhTNF对胃癌细胞凋亡及细胞周期的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌BGC-823细胞，在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的 DMEM高糖培养基中传代培养;rmhTNF由第四军医大学和上海赛达生物药业有限公司合作，应用蛋白质工程技术改造天然TNFalpha制成;OXA，50 mg/支;原位细胞凋亡检测试剂盒，流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 细胞常规培养，调整为(4～5)×105/ml的单细胞悬液;以1.5 ml/孔接种培养板，放入培养箱中培养24 h;弃旧培养液，随机分为A、B、C、D 组，分别加入含500 U/ml rmhTNF、12.5 μg/ml OXA、500 U/ml rmhTNF+12.5 μg/ml OXA及不加药物的培养液1.0 ml;继续培养72 h后，弃去旧培养液;PBS液冲洗3遍，用新制备的40 g/L多聚甲醛溶液固定。

1.2.2 细胞周期及细胞凋亡检测方法 收集各组细胞，采用流式细胞仪分析细胞周期分布与凋亡率。取各组单细胞悬液，4℃下以1 000 r/min离心5 min;加入4℃的70%冷乙醇，固定12 h以上;弃去乙醇，加入RNA酶消化;37℃水浴30 min后冰浴，采用碘化丙锭(PI)一步插入性DNA定量荧光染色法染色，以500目筛网过滤成合格的单细胞悬液，上机检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。组间比较行方差分析和LSD检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组BGC-823细胞周期及凋亡情况比较，见表1。

表1 各组BGC-823细胞周期及凋亡情况比较(%，±s)

表1 各组BGC-823细胞周期及凋亡情况比较(%，±s)

注:与 D 组比较，*P ＜0.05;与 A、B、D 组比较，#P ＜0.05

组别 G0/G1 S G2/M 细胞凋亡率A 组 25.49±0.83* 31.37±0.68* 45.32±0.97* 39.52±0.95*B 组 47.29±0.98* 30.02±0.53* 23.44±0.93* 15.29±0.91*C 组 19.45±0.94*#10.60±0.79*#71.47±1.32*# 60.37±0.99*#D组55.28±1.24 19.55±0.70 26.71±0.43 3.42±0.64

3 讨论

化疗药物主要通过线粒体凋亡途径对肿瘤细胞发挥杀伤效应。当凋亡信号通过各种机制引发线粒体功能结构变化，导致线粒体通透性转换孔(PTP)不可逆性开放，使细胞色素C释放到细胞质，并与Apaf及dATP结合，活化Caspase-9而触发Caspase级联反应，诱导凋亡［1］;线粒体内膜完整性及通透性是维持线粒体功能的前提，线粒体内膜损伤，通透性增加，可促进细胞色素C和其他凋亡诱导因子的释放［2，3］。胃癌细胞凋亡诱导阈值较高，则该凋亡途径不能进行，使肿瘤细胞对化疗药不敏感。

研究发现［4，5］，化疗联合高浓度的 TNF-α 可治疗一些难治性恶性肿瘤，同时可避免出现严重药物不良反应，可能与TNF-α对细胞毒性化疗药物具有增敏作用有关。因此，有研究［6］应用蛋白质工程技术改造天然TNF，制成高活性、低毒性的rmhTNF。本研究结果显示，OXA联合rmhTNF作用胃癌细胞后，G2/M期细胞比率增加，而G0/1、S期细胞比率下降，细胞凋亡率为60.37%±0.99%，显著高于单用OXA、rmhTNF，提示奥沙利铂联合rmhTNF可协同阻滞胃癌细胞处于G2/M期，诱导细胞凋亡。

研究［7］发现，rmhTNF通过纠正肿瘤细胞线粒体膜抵抗凋亡的能力，使该凋亡通路恢复，增加了胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性。rmhTNF还可增加肿瘤细胞TNFR与TNF的结合率，有利于死亡受体途径凋亡程序的启动;并通过凋亡信号通路的交叉和反馈［8］，放大多种下游效应Caspase的促凋亡作用。奥沙利铂和rmhTNF分别激活不同的Caspase，并级联和放大有关凋亡信号，因而对细胞凋亡产生了协同作用［9，10］。NF-кB 基因位于多药耐药基因上游，与启动子的转录相关。rmhTNF可抑制NF-кB表达，从而阻断多药耐药基因转录，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，降低了其抗凋亡能力，从而达到了治疗耐化疗药物肿瘤的目的［11］。

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