磷脂酰肌醇－3－羟基激酶抑制剂LY294002对肝细胞生长因子促人结肠癌细胞SW620增殖和迁移行为的影响

王振宝，吕品田，贾漪涛，王志敏，黄万刚，耿瑞超，李中信

磷脂酰肌醇－3－羟基激酶抑制剂LY294002对肝细胞生长因子促人结肠癌细胞SW620增殖和迁移行为的影响

王振宝，吕品田，贾漪涛，王志敏，黄万刚，耿瑞超，李中信

目的 探讨磷脂酰肌醇－3－羟基激酶 (PI3K)抑制剂LYZ94002在肝细胞生长因子 (HGF)促进结肠癌细胞SW620增殖、侵袭中所起的作用。方法 分别用噻唑蓝比色法 (MTT)、流式细胞术及划痕实验检测结肠癌细胞增殖、细胞周期、凋亡及移行情况。结果 (1)MTT法结果显示，LY294002≥20 μmol/L实验组与对照组吸光度(OD)值比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。(2)流式细胞术结果显示，LY294002≥20 μmol/L实验组与对照组凋亡率及增殖指数比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。(3)划痕实验结果显示，LY294002≥40 μmol/L实验组与对照组移行距离比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。结论 PI3K信号通路抑制剂能够阻断HGF对人结肠癌细胞增殖、凋亡、移行的促进作用。

PI3K/AKT;肝细胞生长因子;结肠肿瘤;细胞增殖;细胞凋亡;移行

结直肠癌是我国胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，随着生活环境和饮食习惯及结构的改变，其发病率呈逐年上升的趋势。尽管目前采用了包括手术、化疗和放疗在内的综合治疗，但总体效果仍不令人满意，其总的5年生存率仍徘徊在60%～70%［1］。治疗失败的主要原因在于肿瘤发生了复发、转移。然而，恶性肿瘤复发转移的确切机制远未阐明。

在已知的多个参与肿瘤转移基因当中，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)备受关注。HGF是一种多功能的生物学因子，具有强促分裂、组织成形、诱导上皮细胞迁移、侵袭以及诱导血管生成等作用［2］，可由多种细胞分泌。HGF的受体是c－Met癌基因编码的c－Met蛋白。正常的HGF/c－Met信号转导在胚胎发育、组织损伤修复中起重要作用，而异常的HGF/c－Met信号转导与肿瘤发生，尤其是侵袭和转移密切相关［3］。有资料显示，结直肠癌患者血浆中的HGF水平增高，且分期越晚，HGF的表达水平越高，合并肝转移的结直肠癌患者较无肝转移的结直肠癌患者的HGF表达水平更高［2－4］。磷脂酰肌醇 －3 － 羟基激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT)是HGF下游信号通路中的一条，参与了许多生物功能的调节如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡，调控细胞周期等，但同时有研究显示肿瘤的生成与发展也与PI3K/AKT途径有关［5］。

我们在前期的研究中发现，HGF可以促进人结肠癌细胞SW620的增殖、移行，并使细胞内微丝、微管数量增加［6］。但尚不清楚阻断PI3K/AKT信号传导通路是否会抑制HGF的促SW620增殖及侵袭作用。

本实验在人结肠癌细胞SW620中加入PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002后加入人重组肝细胞生长因子 (rhHGF)，应用噻唑蓝比色法 (MTT)、划痕实验、流式细胞术，观察用LY294002阻断PI3K/AKT信号通路对HGF的促进结肠癌细胞SW620增殖、移行作用的影响，以期阐明PI3K/AKT信号通路对HGF/c－Met促进肿瘤增殖、移行的细胞内信号传导机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SW620人结肠癌细胞系由浙江大学郑树教授惠赠，rhHGF购自PEPROTECH公司 (美国)，U0126购自 Invitrogen/GIBCO公司 (美国)。

1.2 方法

1.2.1 人结肠癌细胞SW620的培养 SW620细胞株用沙氏琼脂培养基 (RPMI－1640)置于37℃、5%二氧化碳 (CO2)的条件下细胞培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，每2～3 d用胰酶消化，传代培养。

1.2.2 MTT法分析LY294002对SW620增殖的影响 将SW620细胞以1.0×104/ml浓度接种于96孔培养板，实验组分6组，前5组加入终浓度为80、40、20、10、5 μmol/L的LY294002，第6组加终浓度为0.1%体积浓度的二甲基亚砜(DMSO)为DMSO组，对照组加入同体积的培养液。30 min后各组均加入终浓度为20 μg/L的HGF，培养48 h后测定各孔的吸光度 (OD)值。抑制率为: (OD对照组－OD实验组)/OD对照组×100%。实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测LY294002对SW620细胞周期、凋亡的影响 将SW620细胞以1.0×106/ml浓度接种于培养瓶，实验组4组分别加入终浓度为 80、40、20、10 μmol/L的LY294002，对照组加入同体积的培养基，30 min后5组分别加入终浓度为20 μg/L HGF，培养48 h后收集细胞、漂洗离心、固定、送流式细胞仪检测，增殖指数 (PI)=合成期(S)、分裂前期 (G)、分裂期 (M)细胞总数占不同细胞周期的细胞数的百分比，即 (S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.4 划痕实验检测LY294002对SW620移行的影响 将SW620细胞以2.0×106/孔接种于六孔培养板中，8 h后用10 μl枪头在6孔培养板上划痕，实验组分为3组，前2组加入终浓度为80、40 μmol/L的LY294002，第3组为 DMSO组加入终浓度为0.1%体积浓度的DMSO，对照组加同体积的培养液。30 min后各组加入终浓度为20 μg/L的HGF，24 h后观察细胞生长情况并更换培养基并加入相应浓度的LY294002、HGF，继续培养。每24 h重复上述步骤，直至第3 d。采用Image pro plus软件测量划痕空白区宽度，并计算出其移行距离 L(μm)，公式为:L(μm)=(L 0 h－L n h)/2。移行距离抑制率为:(L对照组－L实验组)/L对照组×100%。实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料用(±s)表示，组间比较采用单因素多水平方差分析 (one way ANOVA)，多重比较用SNK－q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY294002对SW620增殖的影响 应用MTT法结果显示，不同浓度实验组、DMSO组、对照组OD值比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。其中终浓度为 80、40、20 μmol/L LY294002实验组与对照组OD值比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);且这3个浓度组间OD值比较，差异亦有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。3个浓度组对SW620增殖的抑制率分别为35.1%、29.9%、14.2%。

2.2 LY294002对凋亡、细胞分裂周期的影响 流式细胞术显示，不同浓度实验组与对照组凋亡率比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。其中终浓度为80、40、20 μmol/L LY294002实验组与对照组凋亡率比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);且这3个浓度组间凋亡率比较，差异亦有统计学意义 (P＜0.05)。实验组与对照组PI比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。其中终浓度为80、40、20 μmol/L LY294002实验组与对照组PI比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);且这3个浓度组间PI比较，差异亦有统计学意义 (P＜0.05，见表2)。

表1 LY294002不同浓度对SW620细胞增殖的影响Table 1 The effect of LY294002 of different concentrations on the proliferation of SW620 cells

表2 LY294002对SW620细胞凋亡率及PI的影响(±s)Table 2 The effect of LY294002 on the apoptosis ratio and PI of SW620cells

表2 LY294002对SW620细胞凋亡率及PI的影响(±s)Table 2 The effect of LY294002 on the apoptosis ratio and PI of SW620cells

注:与对照组比较，▲P＜0.05;与对照组比较，△P＞0.05;与20 μmol/L组比较，*P ＜0.05;与40 μmol/L组比较，■P ＜0.05

组别 次数 凋亡率PI实验组(μmol/L)80 3 1.45±0.06▲＊■ 35.1±2.2▲＊■40 3 1.20±0.08▲＊ 44.8±1.4▲＊20 3 1.04±0.12▲ 48.6±2.2▲10 3 0.74±0.14△ 52.5±1.1△对照组 3 0.61±0.08 55.2±2.8 F 58.92 72.99 P值值＜0.05 ＜0.05

2.3 LY294002对SW620移行的影响 划痕实验显示，药物作用24 h、48 h、72 h后实验组、DMSO组与对照组移行距离比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。其中24 h后，80 μmol/L LY294002实验组与对照组移行距离比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);48 h、72 h后80、40 μmol/L LY294002实验组与对照组移行距离比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05);而24 h、48 h、72 h后DMSO组与对照组移行距离比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05)。80 μmol/L LY294002实验组24 h、48 h、72 h的移行距离抑制率分别为61.2%、61.7%、54.3%(见表3)。

表3 LY294002不同时间对SW620细胞移行距离及其抑制率的影响Table 3 The effect of LY294002 on the migration ratio of SW620 cells

3 讨论

HGF是一种广泛分布于各组织的细胞外信号因子，不仅存在于多种正常组织细胞内，而且一些肿瘤细胞也可以产生。有研究发现结直肠癌患者的血浆中HGF水平明显高于正常人［5］。我们的前期实验表明，HGF可以促进SW620细胞的增殖、移行及上调血管内皮生长因子A(vascular endothelial cell growth factor A，VEGF－A)、VEGF－C、VEGF－D 的表达［6］。另有研究显示，PI3K/AKT通路在细胞中普遍表达信号途经，不仅参与正常细胞的生理活动，还与肿瘤侵袭、转移等多种生物行为有关［7］。在未转化的肠上皮细胞和结肠肿瘤细胞中，PI3K/AKT信号通路已经证实能够转导来自生长因子受体的促有丝分裂信号［8］。本实验应用 PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002抑制了HGF促SW620细胞增殖、移行及抗凋亡的作用。

本研究结果显示，不同浓度的LY294002抑制HGF对SW620细胞增殖的抑制率是不同的，即浓度较高的LY294002抑制HGF对SW620细胞增殖作用大，提示LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性可以抑制HGF促进SW620增殖的生物学活性，而被激活的PI3K是靠进一步激活其下游AKT来发挥作用的。Nanaw等［9］发现人类结肠直肠肿瘤组织中磷酸化AKT表达增多，活化的AKT通过促进细胞增殖并抑制其凋亡从而促进肿瘤的发生发展。

本研究结果显示，不同浓度的LY294002对SW620细胞凋亡率是不同的，浓度较高的对SW620细胞的凋亡率较高，LY294002有效地抑制了HGF促进SW620细胞周期进程，起到抗凋亡作用，提示LY294002可能是通过抑制PI3K进而抑制了其下游细胞信号的传导而导致了SW620细胞增殖减少、凋亡率增加。这与文献报道的一致［10］。这些研究都为抑制PI3K即能抑制HGF促进SW620细胞周期进程、抗凋亡的生物学活性提供了有力的证据。

本研究结果显示，高浓度的LY294002可以抑制20 μg/L HGF对SW620促移行作用。本实验加入PI3K抑制剂后出现移行距离缩短，证明抑制PI3K信号通路可以抑制HGF对SW620细胞促移行作用。研究显示，作为PI3K下游信号的AKT可促进细胞内肌动蛋白中间丝重构从而提高细胞运动能力［11］。

HGF通过激活c－Met受体使其发生自体磷酸化，被激活的c－Met受体与细胞内的一些靶蛋白直接作用导致包括PI3K/PKB、ERK/MAPK、磷脂酶、生长因子受体结合蛋白及其相关蛋白、转录激活子STAT等信号传递途径的级联激活。由此可见HGF是靠多条信号通路发挥其生物学作用的，抑制其中某一条通路是否会出现抑制肿瘤的作用，不仅与该信号通路是否管理着细胞的存活生长机制;在该机制中所起作用的多少;是否会产生负反馈调节;还与阻断该信号途经其他信号途经是否会代偿性增强等有关。不同基因在不同种类的细胞中表达量是不同的，即使是同一种肿瘤中，不同个体肿瘤内某一关键蛋白表达量也是有所差别的，本实验结果的产生也与HGF及其受体c－Met和PI3K在该细胞中表达的相对水平有关，而且对于抑制该信号途经关键分子PI3K后其下游信号即AKT的量是否下降也需进一步检测。

总之，PI3K抑制剂LY294002能够抑制HGF促进肿瘤细胞SW620的增殖、移行及抗凋亡作用，这为探索新的治疗结直肠癌方法提供了实验依据。

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5 Lee SH，Lee JW，Soung YH，et al.Colorectal tumors frequently express phosphorylated mitogen－activated protein kinase［J］ .APMIS，2004，112:233－238.

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The Role of PI3K Inhibitors(LY294002)in the Proliferation，Apoptosis and Migration of SW620 Activated by HGF

WANG Zhen－bao，LV Pin－tian，JIA Yi－tao，et al.The Second Department of Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo investigate the role of PI3K inhibitors(LY294002)in the proliferation，apoptosis and migration of SW620 activated by HGF.MethodsThe proliferation of SW620 cells activated by HGF was assessed by MTT，while the apoptosis was examined by Flow Cytometry(FCM)and the migration was detected by Scratch test.Results(1)MTT test showed that LY294002≥20 μmol/L，and the difference of OD value between experiment group and control group was statistically significant(P ＜0.05).(2)Flow cytometry showed that LY294002≥20 μmol/L.The differences of apoptosis rate and proliferation index between experiment group and control group were statistically significant(P＜0.05).(3)Scratch test showed that LY294002≥40 μmol/L.The difference of migration of SW620 between experiment group and control group was statistically significant(P＜0.05).ConclusionPI3K/AKT signaling pathway can inhibit the activation of proliferation，apoptosis and migration of SW620 by HGF.

PI3K/AKT;Hepatocyte growth factor;Colonic neoptasms;Cell proliferation;Apoptosis;Migration

R 735.3

A

1007－9572(2011)12－4170－03

国家自然科学基金 (81172332)

050051河北省石家庄市，河北医科大学第四医院外二科 (王振宝，黄万刚，耿瑞超，李中信);河北省人民医院肿瘤二科(吕品田);河北省人民医院肿瘤三科 (贾漪涛);河北省邢台市肿瘤医院腹瘤科 (王志敏)

李中信，050051河北省石家庄市，河北医科大学第四医院外二科;E－mail:lizhongxin99@yahoo.com.cn

2011－09－15;

2011－11－15)

(本文编辑:丁云)