晚期结直肠癌患者树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗效果研究

元建华，彭大为，李建旺，王美清

晚期结直肠癌患者树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗效果研究

元建华，彭大为，李建旺，王美清

目的 探讨树突细胞 (DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK)治疗晚期结直肠癌患者的临床疗效。方法 将40例临床确诊的晚期结直肠癌患者随机分为两组，观察组给予免疫治疗联合化疗，对照组仅给予化疗。观察两组患者治疗前后细胞免疫指标 (CD3+、CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+)变化、卡氏评分 (Karnofsky，KPS评分)和疗效，并观察其不良反应。结果 观察组患者治疗后CD3+细胞的比例较治疗前显著增加，差异有统计学意义 (P=0.001);而CD4+、CD8+细胞的比例及CD4+/CD8+治疗前后比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。对照组免疫学指标 (CD3+、CD4+、CD8+细胞的比例及CD4+/CD8+)治疗前后比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05)。观察组患者治疗后有效率为45%，对照组有效率为35%，两组比较差异无统计学意义 (P＞0.05);观察组KPS评分总提高率为80%，对照组为60%，两组比较差异有统计学意义 (P＜0.05)。结论 DC联合CIK治疗可明显改善晚期结直肠癌患者外周血淋巴细胞亚群水平，能提高患者的生活质量。

树突细胞;细胞因子诱导的杀伤细胞;结直肠肿瘤;免疫治疗

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，占所有肿瘤患者的10% ～15%［1］。随着国内生活水平的提高，其发病率呈逐年上升趋势，男女性结直肠癌发病率均位居第三。尽管有40%～50%的结直肠癌患者可通过手术治愈，但至少20%的患者诊断时已发生转移，而晚期转移患者的5年生存率低于10%［1］。因此，探索新的结直肠癌治疗手段、以树突细胞 (dendritic cells，DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞 (cytokine－induced killers，CIK)为基础的肿瘤细胞免疫治疗成为目前研究的热点之一。多项研究表明DC与CIK具有协同作用，共同孵育后DC共刺激分子的表达及抗原递呈能力均可提高，且CIK的增殖能力和细胞毒性也进一步增强［2－3］。目前DC联合CIK治疗多应用于血液系统肿瘤患者，用于晚期结直肠癌的治疗报道很少。本研究采用DC联合CIK治疗40例晚期结直肠癌患者，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年1月—2011年3月我院肿瘤科收治的42例晚期结直肠癌患者，均经病理组织学或细胞学检查确诊为晚期结直肠癌平均至少有一处可测量病灶，其中结肠癌26例、直肠癌16例;男31例，女11例;腺癌37例，黏液腺癌4例，印戒细胞癌1例;初治10例，复治32例;所有患者卡氏评分 (Karnofsky，KPS评分)≥60分，预计生存期≥3个月，1个月内未接受过其他任何抗肿瘤治疗。

采用随机数字法将42例患者分为两组。观察组21例，男15例，女6例;年龄46～78岁，中位年龄60岁;16例复治。对照组21例，男16例，女5例;年龄45～76岁，中位年龄58岁;14例复治。

1.2 方法 对照组患者仅给予单纯化疗，观察组患者给予DC－CIK联合化疗，回输按照下述的途径来进行:包括4次静脉CIK、4次静脉DC输注及相关的临床观察和检测程序，回输时间12～14 d。

1.2.1 细胞分离 观察组21例患者经CS－3000血细胞分离机采集患者自身外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，再用聚蔗糖400(Fieoll 400，中国科学院生物物理研究所)分离后经磷酸盐缓冲液 (PBS)液洗3次，收集纯度在90%以上的PBMC。

1.2.2 DC细胞的体外培养和扩增 将CS－3000分离得到的PBMC，每次采集细胞总数在为 (1.6～4.6) ×109，PBMC用pH 7.4的PBS洗涤3次，将细胞按2×106/ml数量悬浮于RPMI－1640完全培养基 (内含10%胎牛血清和5%AB血清)，培养2 h，弃上清，获得贴壁的PBMC，向每孔加入完全培养基［含200 μg/L粒细胞－单核细胞集落刺激因子 (rhGMCSF)和50 μg/L重组人白介素4(rhIL－4)］，每2 d半量换培养基，培养5 d［4］，观察DC的形态和增殖情况，第7天加入干扰素γ(INF－γ)1 000 U/ml和肿瘤坏死因子α(TNF－α)200 μg/L，16 h后收集细胞进行细胞表面标志检测和无菌检验合格后进行细胞回输治疗。

1.2.3 CIK细胞体外培养和扩增 PBMC经pH 7.4的PBS洗涤3次，将细胞按2×106/ml数量悬浮于RPMI－1640完全培养基 (内含10%胎牛血清和5%自身灭活血浆)并加入2 000 ml的细胞培养袋，加重组人干扰素 (rh－IFN)1 000 U/ml，24 h后加入抗 CD3单克隆抗体 (抗 CD3－MoAb)1 mg/L，rhIL －2 50 U/ml，IL －2 1 000 U/ml，CD3－ MoAb 50 μg/L，IL－1a 1 000 U/ml。此后每2 d半换液并计数，培养7 d后，经细菌和霉菌培养阴性后再收集细胞，用无菌0.9%氯化钠注射液洗3次，将细胞悬浮于自身血浆中，加入5×104U/L rhIL－2，用输血器回输给患者，2 h内输完。

1.2.4 细胞回输 收集12～14 d的CIK细胞，每次回输的细胞存活率应＞95%，细胞总数＞1×1010个。600 r/min×10 min离心，洗涤2次后，细胞溶于0.9%氯化钠注射液100 ml，细胞＞1010/ml，静脉滴注，2 h内回输患者体内。收集10～14 d的悬浮的经过表型鉴定的成熟DC，细胞＞1×106/ml，溶于100 ml 0.9%氯化钠注射液，静脉滴注，2 h内回输患者体内。

1.3 观察指标 按WHO实体瘤的近期疗效标准分为完全缓解 (CR)、部分缓解 (PR)、稳定 (SD)、进展 (PD)4级。生活质量变化:记录患者症状及体征变化，用KPS计分法判断治疗前后的变化，凡在治疗后较治疗前记分提高10分以上者为改善;而下降10分以上者为恶化;提高或下降10分者为稳定，总提高率为改善+稳定［5］。治疗结束后4周进行疗效评价。

免疫学评价:治疗结束后4周，评价两组患者治疗前后外周血中CD3+、CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+的变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计检验。计量资料以(±s)表示，采用t检验;率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效 42例患者治疗中1例失访，1例因经济原因中途退出。治疗后观察组CR 0例，PR 9例，SD 6例，PD 5例，有效率 (CR+PR)45%;KPS评分提高7例，稳定9例，恶化4例，总提高率为80%。对照组CR 0例，PR 7例，SD 6例，PD 7例，有效率35%;KPS评分提高4例，稳定8例，恶化8例，总提高率为60%。两组有效率比较，差异无统计学意义 (χ2=2.87，P＞0.05);而两组KPS评分总提高率比较，差异有统计学意义 (χ2=7.26，P＜0.05)。

观察组回输过程中出现短暂发热 (但＜38℃)2例，未予特殊治疗好转。

2.2 治疗前后患者外周血淋巴细胞表型变化 观察组患者经DC联合CIK治疗后4周，外周血中CD3+细胞的比例较治疗前显著增加，亦较对照组治疗后显著增加，差异有统计学意义(P＜0.01);对照组患者治疗后外周血中CD3+、CD4+、CD+8细胞的比例及CD4+/CD8+与治疗前比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

表1 观察组和对照组患者治疗前后细胞免疫指标变化的比较(±s，%)Table 1 Changes of T cell subgroup in peripheral blood before and after treatment in two groups

表1 观察组和对照组患者治疗前后细胞免疫指标变化的比较(±s，%)Table 1 Changes of T cell subgroup in peripheral blood before and after treatment in two groups

注:与对照组治疗后比较，*P＜0.05

组别 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+观察组(n=20)治疗前 54±10 30±6 29±5 1.61±0.65治疗后 64± 7* 34±8 27±4 1.94±0.64 t 0.001 0.088 0.186 0.106对照组(n=20)4.029 1.797 1.373 1.697 P值值治疗前 56±12 31±7 27±6 1.58±0.76治疗后 54± 6 30±5 27±5 1.54±0.46 t 0.817 0.815 0.361 0.210 P值值0.420 0.425 0.722 0.836

3 讨论

肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能有着密切的关系，因此，通过提高肿瘤组织对宿主的免疫源性和增强机体对肿瘤细胞的免疫应答能力来抑制或消除肿瘤的免疫治疗是抗肿瘤治疗的重要方法之一，肿瘤免疫治疗已被众多学者认为是具有较大潜力的治疗措施，它能较彻底地清除残余的肿瘤细胞，是目前肿瘤综合治疗研究的热点之一。

DC由美国学者Steinman等［6］于1973年发现，是目前已知体内抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞，它表面高水平表达的MHCⅠ类和Ⅱ类分子可有效提呈肿瘤抗原多肽，并高水平表达刺激分子CD80、CD86、CD40、CD50等共刺激分子，提供T细胞激活所必需的第二信号。DC与T细胞结合后，大量分泌IL－12，诱导Th1型应答，有利于肿瘤细胞的清除［7－8］。根据DC的来源，可将其分为骨髓来源DC和类浆细胞DC两类［9］。CIK又称为NK细胞样T淋巴细胞，是将人PBMC在体外经过多种细胞因子 (IFN－γ、IL－2、抗CD3－MoAb、IL－1a等)共同诱导而获得的一群异质细胞，同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子［10］，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制杀瘤特点。大量研究表明，DC与CIK细胞共培养后可促进 DC 和 CIK 细胞成熟［2－3，11］。

Burgdorf等［12］提取直肠癌患者的PBMC，经含有肿瘤细胞表面抗原的肿瘤细胞裂解物反复冲击，从而致敏DC形成疫苗。17例直肠癌患者每人2周注射1次疫苗，共注射10次，结果显示SD 4例。吴艳峰等［13］进行的一项用抗原致敏的DC治疗晚期大肠癌患者的临床研究，结果显示观察组的有效率为44.83%，对照组的有效率为22.58%。李敏等［14］应用凋亡小鼠B细胞淋巴瘤细胞A20负载的DC来制备凋亡肿瘤细胞负载的DC(AP－DC)，A20荷瘤小鼠分别被注射AP－DC、2A单抗或二者联合。结果表明单独注射AP－DC和2A单抗的有效率分别为12.5%和5.0%;二者联合的有效率为62.5%，并且荷瘤鼠可长期生存。

本研究结果显示，DC联合CIK治疗后晚期结直肠癌患者的细胞免疫学指标 (CD3+细胞比例)较治疗前显著提高，提示DC联合CIK治疗后患者细胞免疫能力明显增强。而对照组患者在化疗前后细胞免疫指标无显著变化，说明患者的免疫状态和水平无明显改善。此外，观察组患者治疗后CD3+细胞比例显著高于对照组，说明了观察组相对于对照组而言，在提升患者免疫水平方面有明显的优势。按WHO实体瘤的近期疗效标准，观察组治疗后有效率45%，对照组有效率35%，两组疗效间无显著差异;观察组KPS评分总提高率为80%，对照组KPS评分总提高率为60%，两组间有显著差异。提示DC联合CIK治疗与单纯化疗比较，患者的生活质量明显改善，疗效上有提高的趋势，为免疫治疗可能在晚期结直肠癌患者的治疗方面发挥更大的作用提供部分临床资料或依据。由于本研究随访时间短，目前多数患者病情稳定，仍需随访其远期疗效及对患者生存期的影响。

综上所述，DC联合CIK能明显提高晚期结直肠癌患者的免疫功能，改善临床症状，提高患者的生存质量，并有改善患者疗效的趋势，为晚期结直肠癌患者提供了新的治疗手段。

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Clinical Research of Dendritic Cells Combined with Cytokine Induced Killer Cells Therapy for Advanced Colorectal Cancer

YUAN Jian－hua，PENG Da－wei，LI Jian－wang，et al.Haikou Municipal Hospital，Haikou 570208，China

ObjectiveTo evaluate clinical effects of dendritic cells(DC)combined with cytokine induced killer cells(CIK)therapy for advanced colorectal cancer.MethodsForty advanced colorectal cancer patients were randomly divided into treatment group and control group.The treatment group was given immunotherapy combined with chemotherapy.The treatment group was also given DC and CIK at an interval of 10～14 days after chemotherapy.The control group was only given chemotherapy.T lymphocyte subtypes in peripheral blood of two groups(CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+)were analyzed before and after treatment.Performance Status(KPS)，clinical effects and side effects were observed.ResultsThe level of CD3+showed significant difference before and after treatment in the treatment group(P=0.001)，while the levels of CD4+，CD8+，CD4+/CD8+showed no significant difference before and after treatment(P＞0.05).The levels of CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+showed no significant difference before and after treatment in the control group(P＞0.05).The effective rate in treatment group and control group was 45%and 35%respectively(P＞0.05);The effective rate of KPS in treatment group and control group was 80%and 60%respectively，the difference was statistically significant(P ＜0.05).ConclusionDC combined with CIK therapy can improve T lymphocyte subtypes in peripheral blood of advanced colorectal cancer patients，and it can also improve thelife quality of patients.

Dendritic cells;Cytokine induced killer cells;Colorectal neoplasms;Immunotherapy

R 735.34

A

1007－9572(2011)12－4139－03

570208海南省海口市人民医院肿瘤科

彭大为，570208海南省海口市人民医院;

E－mail:yuan200908@sina.com

2011－06－12;

2011－11－13)

(本文编辑:刘莉)