HPLC法测定癸氧喹酯固体分散体有关物质及其含量

肖 芳，周 霁，严少康，黎璐平，刘永琼

(武汉工程大学化工与制药学院，绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室，湖北 武汉 430074)

0 引 言

癸氧喹酯(decoquinate)为喹啉类抗球虫病药，能阻断虫体线粒体电子传递链中辅酶Q10与细胞色素b之间的电子转运，抑制柔嫩艾美耳球虫的呼吸作用，使球虫不能正常发育，从而起到抗球虫的作用.癸氧喹酯常用于防治鸡的柔嫩、毒害、堆型、巨型、变位和布氏艾美耳球虫等引起的球虫病，另外，癸氧喹酯对隐孢子虫引起的动物腹泻也可以起到缓解和治疗作用[1-2].由于癸氧喹酯不溶于水和大多数有机溶剂，目前国内市场上销售的制剂品种只有癸氧喹酯的预混剂.本文通过药物制剂新技术将难溶性的癸氧喹酯制成固体分散体可改善其在水中的溶解度，从而提高其生物利用度.为了制定其科学合理的质量控制方法，参照相关文献[3-6]，建立了高效液相色谱法对癸氧喹酯固体分散体中的有关物质及含量进行分离、测定.

1 实验部分

1.1 仪器

高效液相色谱仪(DIONEX，P680 HPLC PUMP)；色谱柱(C185μm，4.6×250mm，Dionex)；UV-VIS8500型紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；台式干燥箱(中外合资重庆四达实验仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(重庆银河试验仪器有限公司).

1.2 材料与试剂

癸氧喹酯原料药(浙江新三和动物保健品有限公司提供，批号：20080501，质量分数98.00%)；癸氧喹酯对照品(本实验室精制，质量分数99.20%)；癸氧喹酯固体分散体(自制，批号：20080517，20080519，20080521)；药用铝箔袋(昆山市天地包装材料有限公司)；甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；二氯甲烷(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；氯化钙(分析纯，天津博迪化工有限公司)；娃哈哈纯净水.

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 溶剂的制备 二氯甲烷-无水甲醇(1∶6)溶液(每1 000 mL溶剂加入10 g氯化钙).

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取样品适量(约相当于癸氧喹酯40 mg)置于100 mL容量瓶，加少量溶剂超声使之完全溶解，用溶剂稀释至刻度，精密量取10 mL于100 mL容量瓶，用溶剂定容即得(质量浓度40 μg/mL).

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取约40 mg癸氧喹酯对照品置于100 mL容量瓶，加少量溶剂超声使完全溶解，用溶剂稀释至刻度，精密量取10 mL于100 mL容量瓶，用溶剂定容，即制成质量浓度为40 μg/mL的对照品溶液.

2.2 色谱条件

用十八烷基键合硅胶为填充剂；以无水甲醇为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为20 μL；检测波长为267 nm；理论塔板数不低于1 500.

2.3 方法学考察

2.3.1 空白溶剂及空白辅料的干扰实验 在色谱条件2.2下，分别测定空白溶剂、对照品溶液、空白辅料溶液、供试品溶液的高效液相色谱图(图1～4).由图1可知空白溶剂的保留时间为2.8 min，不干扰样品测定.由图2可知：癸氧喹酯的保留时间为4.8 min，用面积归一化法测定癸氧喹酯对照品含量为99.23%，理论塔板数>1 500.由图3、4可知溶液中辅料及其他杂质与癸氧喹酯可完全分离，不干扰样品测定.

图1 空白溶剂HPLC色谱图

图2 对照品溶液HPLC色谱图

图3 空白辅料HPLC色谱图

图4 供试品溶液HPLC色谱图

2.3.2 检测线 取癸氧喹酯对照品溶液，逐级稀释，分别取样20 μL注入液相色谱仪，直至主峰峰高为基线噪音的3倍，结果表明，最低检测限为0.05 μg/mL.

2.3.3 专属性实验a.酸破坏实验.酸溶液的配制：取5 mL HCl和5 mL的无水乙醇混匀配制成体积分数50%浓盐酸乙醇溶液作为酸溶液.

精密称取样品(批号：20080517)适量(约相当于癸氧喹酯50 mg)置于100 mL容量瓶，加少量溶剂超声溶解后溶剂定容，然后用移液管移取2 mL于25 mL容量瓶中，加2 mL酸溶液，静置，避光放置24 h，溶剂定容，取20 μL进样，照2.2项色谱条件测定，结果见图5.

图5 酸破环实验

b.碱破坏实验.碱溶液的配制：取适量NaOH溶于无水乙醇中，配置成过饱和NaOH溶液作为碱溶液.

精密称取样品(批号：20080517)适量(约相当于癸氧喹酯50 mg)置于100 mL的容量瓶，加少量溶剂超声溶解后溶剂定容，然后用移液管移取2 mL于25 mL容量瓶中，加2 mL碱溶液，静置，避光放置24 h，溶剂定容，取20 μL进样，照2.2项色谱条件测定，结果见图6.

图6 碱破坏实验

c.高温破坏实验.精密称取样品(批号：20080517)适量(约相当于癸氧喹酯50 mg)置于100 mL的容量瓶中，加少量溶剂超声溶解后溶剂定容，然后用移液管移取1 mL于25 mL容量瓶中，置于(105±1) ℃下4 h，再用溶剂定容，取20 μL进样，照2.2项色谱条件测定，结果见图7.

图2～7表明：癸氧喹酯对酸、碱、热较稳定，降解产物与癸氧喹酯分离良好，说明该色谱条件能较好的对本品进行有关物质检查.

2.3.4 线性关系考察 精密量取适量的癸氧喹酯对照品，以二氯甲烷和甲醇的混合溶液(比例为1∶6，每1 000 mL加入10 g氯化钙)为溶剂，配成系列浓度的标准品溶液(1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL)，分别进样20 μL，照2.2项色谱条件测定，以样品浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，其方程为：A=1.647 9C-0.354(R2=0.999 8，n=11).表明癸氧喹酯的含量在1.0～50 mg/mL之间具有良好的线性关系.

图7 高温实验

2.3.5 回收率与精密度实验

a.回收率实验.按照癸氧喹酯固体分散体的处方比例，配制对照品和辅料溶液，混匀，用溶剂配成含癸氧喹酯质量浓度为10、20、30 μg/mL的溶液，每次进样20 μL，每种质量浓度的溶液进样三次，测定结果见表1.由表1结果计算其回收率分别为101.8%、101.2%、100.9%，在98%～102%之间，表明此法准确度高，符合定量分析的要求.

表1 回收率实验结果

b.精密度实验.精密量取适量的癸氧喹酯对照品，以二氯甲烷和甲醇的混合溶液(比例为1∶6，每1 000 mL加入10 g氯化钙)为溶剂，配制质量浓度为20 mg/mL的溶液，进样量为20 mL，注入液相色谱仪中，进样6次，照2.2项色谱条件测定，由表2结果计算其标准偏差S= 0.177 607(n=6)和相对标准偏差RSD=0.84%(n=6)，由RSD=0.84%<2%[7]，知精密度良好.

表2 精密度实验结果

2.4 样品含量测定

取三批放大样品(批号：20080517；20080519；20080521)适量，加二氯甲烷和甲醇(1∶6)的混合溶液(1 000 mL加入10 g氯化钙)适量使之溶解，稀释成约40 μg/mL的溶液，取样20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，以外标法计算癸氧喹酯固体分散体的含量.测定结果见表3.

表3 含量测定实验结果

结果表明，本品三批样品的含量均在标示量的95%～105%范围之内.

3 结 语

a.方法学考察结果说明在建立的色谱条件下，系统适用性良好，线性、溶液稳定性、精密度、回收率均好.

b.建立的高效液相色谱法对癸氧喹酯固体分散体中的有关物质及含量进行分离、测定，能准确检测样品中的有关物质，辅料无干扰，且操作简便、方法可行、准确度高.不同批号的癸氧喹酯固体分散体样品测定结果表明，癸氧喹酯含量稳定，可用于质量控制.

c.由专属性结果显示，降解产物与癸氧喹酯分离良好，说明该色谱条件能较好的对本品进行有关物质检查.

参考文献：

[1] 都业良.癸氧喹酯对AA肉鸡感染Eimeria tenella 疗效的研究[J].中国农学通报，2009，25(4)：6-9.

[2] Williams R B. Tracing the emergence of drug-resistance in coccidia (Eimeria spp.) of commercial broiler flocks medicated with decoquinate for the first time in the United Kingdom[J]. Vet Parasitol, 2006, 135:1-14.

[3] 中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典[M]．北京：中国农业出版社，2005：附录97，225.

[4] 周玉武，栾明娜，徐福亮，等．高效液相色谱法测定癸氧喹酯溶液的含量[J]．中国兽药杂志，2009,43(2):32-34.

[5] 李嘉宇，戴正琳．HPLC法测定非诺贝特软胶囊的有关物质及含量[J]．武汉工程大学学报，2009(12)：21-23.

[6] 祁雯雯，李俊杰，刘永琼，等．妥曲珠利固体分散物的制备[J]．中国兽药杂志，2009，43(4)：34-37.

[7] 刘文英.药物分析[M].5版.北京:人民卫生出版社,2006：80-83.