基于药代动力学法评价补骨脂提取工艺的研究

霍仕霞，凯赛尔·阿不都克热木，高 莉，彭晓明，王宇卿，闫 明

(1.新疆维吾尔医药研究所，新疆乌鲁木齐 830049;2.石河子大学药学院，新疆 石河子 832000)

中药药代动力学一直是新药研究的热点，以往对中药有效成分研究，单纯地从含量及药效去评价一个工艺的好坏，而忽略了药物在体内吸收、分布的特点。本研究以治疗白癜风的中药补骨脂为研究对象，经过不同工艺处理，得到补骨脂常规粉末、超微粉末、半仿生提取物、水提取物，进行了主要活性成分补骨脂素、异补骨脂素在大鼠体内的药代动力学研究，建立了补骨脂素、异补骨脂素血药浓度的HPLC分析方法，分别阐明了补骨脂不同工艺产物在大鼠体内的代谢过程，比较药代动力学参数，以期揭示补骨脂药效成分在大鼠体内的变化规律，从药代动力学特征比较不同工艺的主成分吸收程度，优选最佳的工艺，为临床前研究提供参考，寻求一种科学简便的新的工艺评价方法。

1 实验材料

DHQ-A型多用混合器(江苏泰县医疗器械厂)，TGL-16B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，BP211D十万分之一电子天平(Sartorius)，超纯水仪，Shimadzu LC-10AD VP泵，Shimadzu SPD-M10A VP二极管阵列检测器，Shimadzu CTO-10A VP柱温箱，Shimadzu CLASS VP 6.2S色谱工作站。补骨脂药材(华康药业提供，产地四川)，补骨脂素、异补骨脂素对照品购自中国药品生物制品检定所，批号分别为(1107397-200310;0738-200108)，甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)。健康Wistar大鼠，♂，体质量(200±30)g，新疆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXY(新)2003-0001。

2 方法与结果

2.1补骨脂不同工艺产物制备

2.1.1常规粉末称取干燥至恒重的140目补骨脂常规粉5.000 g，置25 ml量瓶中，边搅拌边加水，强力振摇，得0.2 g·ml－1(生药)的补骨脂常规粉混悬液，含补骨脂素0.0191 g，异补骨脂素0.0164 g。

2.1.2超微粉末称取干燥至恒重的300目补骨脂超微粉5.000 g，制备方法同上，得补骨脂超微粉混悬液，含补骨脂素0.0175 g，异补骨脂素0.0148 g。

2.1.3半仿生提取物称取干燥至恒重的补骨脂半仿生提取物［1］干浸膏粉1.700 g，制备方法同上，得补骨脂半仿生提取物混悬液，含补骨脂素0.0236 mg，异补骨脂素0.0160 mg。2.1.4水提物称取干燥至恒重的补骨脂半仿生提取物干浸膏粉1.615 g，制备方法同上，得补骨脂水提物混悬液，含补骨脂素0.0215 mg，异补骨脂素0.0148 mg。

2.2血浆样品的制备

2.2.1动物分组及准备取健康wistar大鼠24只(♀♂各半)，随机分组，每组6只，编号记录体质量。分别为补骨脂常规粉末组、超微粉组、半仿生提取物组、水提物组。

2.2.2灌胃给药及血浆收集给药前禁食12 h，自由饮水。大鼠称重，按3g·kg－1(生药)给对应组大鼠灌胃相应的药液。分别在给药前及给药后 0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、9、12、14、24 h于大鼠尾静脉采血，低速离心，分离血浆。取各组各时间点血浆100 μl为待测样品，置－20℃冰箱中冷冻备用［2］。

2.2.3血浆样品处理取待测血浆样品分别加入对照品溶液 200 μl，内标溶液 100 μl，涡漩混匀 10 min，高速离心(1 500 r·min－1)10 min，沉淀血浆中蛋白，取上清液即得血浆样品供试液［3］。

2.3色谱条件及标准溶液的制备色谱条件见参考文献［1］。

2.3.1标准品溶液制备精密称取补骨脂素、异补骨脂素对照品4.26 mg、4.30 mg，分别置于10 ml棕量瓶中加甲醇溶解稀释至刻度冷藏备用。

Tab 1 The pharmacokinetic parameters of psoralcn and isopsoralcn of different technics

2.3.2内标溶液的制备精密称取7-甲氧基香豆素对照品1.46 mg置于100 ml棕量瓶中，加甲醇溶解定容。

2.4标准曲线的制备取3项下补骨脂素、异补骨脂素对照品溶液，逐级稀释得补骨脂素、异补骨脂素混合标准系列溶液。取空白血浆8份，每份100 μl，分别加入上述对照品溶液200 μl，内标溶液 100 μl，按血样处理方法处理血浆样品，取上清液进样20 μl。按照选定的色谱条件分析，记录色谱图，分别计算补骨脂素、异补骨脂素与内标物质的峰面积比值Y。建立回归方程，得:补骨脂素:^Y1=1.898C－0.0598，r=0.9996;线性范围:0.0341 ～1.7040 mg·L－1;异补骨脂素:^Y2=1.509C－0.0546，r=0.9995;线性范围:0.0344 ～1.7200 mg·L－1。

2.5方法回收率与精密度［4］取空白血浆100 μl，分别加入200 μl混合标准溶液制备高、中、低3个不同浓度质控样品(所加入的标液浓度分别为，补骨脂素:4.26、0.852、0.1704 mg·L－1，异补骨脂素:4.30、0.86、0.172 mg·L－1)。每个浓度各6份，分别取各样品上清液20 μl进样测定。计算得补骨脂素平均方法回收率分别为104.94%、97.88%、99.30%，异补骨脂素分别为107.68%、94.38%、99.13%;测得3种浓度标准血浆补骨脂素的日内RSD分别为1.51%、1.03%、0.50%(n=6)，日间 RSD分别为2.75%、2.26%、1.20%(n=6);异补骨脂素的日内 RSD分别为1.24%、1.17%、0.63%(n=6)，日间 RSD分别为3.97%、2.50%、1.55%(n=6)，表明该方法的准确度与精密度良好。

2.6血样的分析测定及药动学参数计算取各给药组各时间点含药血浆样品100 μl，按样品制备方法进行处理，取上清液进样20 μl，记录色谱图。分别计算补骨脂素、异补骨脂素与内标物质的峰面积比值Y，代入标准曲线求得补骨脂素和异补骨脂素的浓度。将各组不同时间点取血测得的血药浓度－时间数据用DAS 2.0药代动力学分析软件处理，得主要药代动力学参数。数据见Tab 1。血药浓度－时间曲线见Fig 2，3，拟合的药－时曲线符合po给药二室模型。

3 讨论

本实验建立了RP-HPLC法测定补骨脂中的补骨脂素、异补骨脂素在大鼠体内血药浓度测定方法，并进行了药代动力学初步研究，以7-甲氧基香豆素作为内标准物，减少系统误差;试验中，选择内标物质时，比较了羟甲香豆素、欧前胡素、联苯胺、7-甲氧基香豆素等物质，其中羟甲香豆素、联苯胺与含药血浆中固有成分有干扰;欧前胡素出峰时间太长造成分析周期过长，综合考虑采用与补骨脂素和异补骨脂素性质类似的7-甲氧基香豆素作为内标物质。

Fig 1 The HPLC chromatograms of reference substance，plasma with reference substance，blank plasm and pastille serum of drug

Fig 2 The drug-time curve of psoralen of different extracts

Fig 3 The drug-time curve of isopsoralen of different extracts8

不同工艺产物中的补骨脂素和异补骨脂素的药代动力学参数比较［5－6］，从MRT来看，常规粉末组＞超微粉组＞水提取物组＞半仿生组，而Tmax为常规粉末组＞水提取物组＞超微粉组＞半仿生提取物组，但异补骨脂素Tmax超微粉组＞水提取物组，表明常规粉末较超微粉末在在大鼠体内滞留的时间长，达峰时间也较长，与其粉碎粒径有很大的关系，其次，补骨脂经提取后，能够促进补骨脂素、异补骨脂素的吸收，缩短达峰时间，更有利于有效成分的吸收和利用;从水提物和半仿生提取物测定结果来看，表明半仿生提取法更符合人体胃肠道吸收原理，模拟药物口服后，经过的酸性、中性、碱性环境，使其有效成分在提取的过程中，转化成易吸收的形式存在。从AUC和Cmax结果比较，超微粉组＞常规粉末组＞半仿生提取物＞水提取物，表明超微粉组的生物利用度最好，Cmax也最大，在相同生药量给药的条件下，均优于半仿生提取物组和水提取物组，含量测定表明超微粉中补骨脂素和异补骨脂素总量均小于其他组，可以得出，超微粉碎技术在实现药材细胞级破壁微粉碎的同时，使其细胞内的有效成分暴露出来，药物的释放速度及释放量增加，大幅度提高了药效成分的利用率;同时，药材经超微粉碎后，很多有助于被测成分吸收的成分也被释放出来。综上所述，从药物在体内的吸收利用程度考虑，利用药代动力学特征评价提取工艺的好坏，更能有利于优选最佳提取工艺，本实验结果表明，药材经提取后，并没有提高主成分的吸收率，可能是煎煮过程中，破坏了能够促进主成分吸收的成分;超微粉碎后的药材粉末更有利于大鼠吸收，关于补骨脂不同工艺产物在大鼠体内代谢情况将进一步研究探讨。

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