BAPTA-AM对HepG-2细胞MT的保护作用及其机制

付再林，宋必卫，施水娟，杨 毅

(浙江工业大学药学院，浙江杭州 310014)

线粒体(mitochondria，MT)是细胞内氧化磷酸化主要场所，在维持细胞生命活动中起着极为重要的作用。MT的损伤可致细胞能量供应中断，MT内Ca2+超载，细胞内自由基水平升高，MT膜屏障功能减低甚至丧失，膜通透性增加、跨膜电位降低、细胞色素C释放等并激活下游凋亡信号通路［1－2］。这些改变将直接或间接导致细胞凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)［3］。大量细胞急性死亡是临床危、重、急症如急性肝衰竭、中风等病的共同病理基础，持续的细胞死亡是许多慢性疾病如帕金森病、老年性痴呆的发病且不断恶化的原因［4］。尽管在细胞死亡机制研究方面已有长足进步，但目前仍然缺乏减少细胞死亡的有效药物，抢救濒危细胞以挽回生命的药物为临床亟需。

钙超载是公认的细胞损伤、死亡的共同环节［5］。理论上，迅速降低细胞内钙，消除钙超载，逆转细胞死亡进程，是挽救濒危细胞可行手段。BAPTA-AM［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N'N'-tetraacetic acid］是一种进入细胞后活化的高效钙络合剂，广泛用于控制细胞内钙水平［5］。本研究以H2O2损伤HepG-2细胞，通过测定MT膜电位、细胞色素C的释放、Caspase-9及 ROS的激活等，观察BAPTA-AM对MT的保护作用，探讨其可能的作用机制，期望发现一种强有力的抢救濒危细胞药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂HepG-2细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司;BAPTA-AM由合肥恒星药物研究所提供;Rhodamine123、MTT购自Sigma公司;细胞色素C(CytC)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，购自Uscn-life公司;Caspase-9活性检测试剂盒、活性氧ROS检测试剂盒购自海门市碧云天生物技术研究所;RPMI 1640培养液、小牛血清、0.25%胰蛋白酶购自上海吉诺医药生物技术有限公司。

1.1.2仪器垂直流超净台(ESCO，SCV-4A1);CO2培养箱(Thermo Electron，Forma 3111);荧光显微镜(Leica Devices);酶标仪(Molecular Devices，Spectramax M2e);离心机(Heraeus，LDZ5-2)。

1.2 方法

1.2.1H2O2诱导HepG-2细胞损伤模型的建立［6－7］将细胞以 104/孔接种于 96 孔板，RPMI 1640培养液培养至细胞生长到70%～80%孔面积。加入终浓度 500 μmol·L－1的 H2O2，分别培养 0、3、6、9、12、15和 24 h，每组设 8 个复孔。MTT 法检测细胞活力:终止培养后加终浓度0.5%的MTT，37℃孵育4 h后DMSO溶解，酶标仪(λ=570 nm)记录各孔吸光度。

1.2.2BAPTA-AM对H2O2诱导HepG-2细胞损伤的影响细胞分为正常对照组、H2O2损伤组、BAPTA-AM(10－8－10－5mol·L－1)4 个保护组。每组8个复孔。保护组分别加入相应浓度的BAPTA-AM培养1 h后，模型组和各保护组均加入500 μmol·L－1H2O2，继续培养9 h，MTT法检测细胞活力。

1.2.3MT膜电位(MMP)的检测［6－7］Rh 123 为膜电位敏感的亲脂性阳离子荧光染料，能选择性地在活细胞MT内聚集，发出黄绿色荧光，其强度可以间接反映MT膜电位(MMP)的高低。细胞接种、分组与处理同“1.2.2”，每组设3个复孔。弃培养液，PBS清洗两次后加含100 μg·L－1Rh 123的无血清培养基中37℃孵育45 min，弃培养液，PBS清洗多次至背景较浅，荧光显微镜观察、拍照。

1.2.4胞质内细胞色素C(CytC)含量测定［6－7］细胞接种于6孔板中，分组与处理同“1.2.2”，收集细胞，PBS稀释使细胞浓度达到200万·ml－1。通过液氮反复冻融破坏细胞以释放出细胞内成份，离心10 min(10 000 r·min－1)收集上清，ELISA法测定CytC含量(按试剂盒说明书操作)。

1.2.5细胞内Caspase-9活性检测［6－7］细胞接种、分组与处理同“1.2.4”，收集细胞，按每200万细胞加入100 μl的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴中裂解 15 min，4℃ 离心 15 min(15 000 r·min－1)。按试剂盒说明书检测Caspase-9催化底物Ac-LEHD-pNA(acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)产生的黄色pNA量，405 nm测定pNA吸光度确定Caspase-9的活性。

1.2.6细胞内活性氧(ROS)含量的测定［8］2'，7'-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)进入细胞后被胞内酯酶水解成不能透过细胞膜的DCFH，从而将探针载入胞内。胞内ROS可将无荧光的DCFH氧化成发出绿色荧光的DCF。其荧光的强弱可以间接反映细胞内ROS的水平。同“1.2.2”分组与处理，PBS清洗细胞两次，加 10 μmol·L－1DCFH-DA，37℃孵育30 min，弃 DCFH-DA，PBS清洗多次至背景较浅，荧光显微镜观察结果。

1.2.7统计学处理采用 GraphPad Prism 5.0软件，数据用±s表示，用One-way或Two-way ANOVA检测均数差异显著性。

2 结果

2.1 BAPTA-AM明显提高受H2O2攻击的HepG-2细胞活力H2O2作用细胞9 h，细胞活力仅为正常对照组的56.1%(Fig 1)。BAPTA-AM浓度依赖性地减轻细胞损伤，在10－6mmol·L－1时效果最佳(活力为93.4%)，再增大剂量则作用有所减弱。

Fig 1 BAPTA-AM protects HepG-2 cells against H2O2-induced injury(MTT method，±s，n=8).

2.2 BAPTA-AM抗H2O2所致的MMP降低由Fig 2可见，H2O2攻击9 h使MT摄取Rh123能力降至正常细胞的7%，MMP崩溃。BAPTA-AM浓度依赖性防止MT对Rh123的摄取能力的溃损，浓度为10－6mol·L－1时作用最佳(与“2.1”结果一致)，表明BAPTA-AM能有效减轻H2O2所致的MT损伤，稳定MMP，维持膜功能。

2.3BAPTA-AM明显抑制CytC的释放由Fig 3A可知H2O2攻击下胞质内CytC明显增加(由MT释放)，12 h时累积量最大。随着损伤时间延长，细胞大量死亡、残留细胞少，故24 h测得的CytC量很低，因此以损伤12 h为观察药效时间点。BAPTAAM明显抑制 CytC的释放(Fig 3B)，浓度为10－6mol·L－1时作用最佳，增加浓度作用反而减弱，与上述结果一致。

2.4BAPTA-AM防止Caspase-9激活Caspase-9的激活可反映出以MT为核心的内源性凋亡通路的激活程度。由Tab 1可知Caspase-9活性随时间延长而增高，6～12 h模型组Caspase-9催化产生的pNA量与正常对照组比较差异有显著性，表明损伤已激活Caspase-9，BAPTA-AM明显抑制Caspase-9激活，10－7mol·L－1时 Caspase-9 的活性已近正常对照组水平，随着浓度增加 Caspase-9的活性可降低至正常基础值以下。

Tab 1 BAPTA-AM prevents the activation of caspase-9 induced by H2O2attack in HepG-2 cells(n=3)

Fig 2 Mitochondrial membrane potential(MMP)labeled with rhodamine123 and detected by fluorescence microscope.BAPTAAM protects mitochondrial membrane against MMP drop induced by H2O2injury.

2.5BAPTA-AM抑制ROS的产生由Fig 4可见细胞损伤(模型组)大量生成ROS，BAPTA-AM浓度依赖性减少ROS的产生，从而抑制ROS对细胞的损伤。

3 讨论

Fig 3 Inhibitory effect of BAPTA-AM on cytochrome C(CytC)release from mitochondria induced by H2O2attack(±s，n=3).

MT和Ca2+超载在细胞死亡中的作用 MT是细胞有氧代谢中心和能量供应站，也是ROS产生中心。MT结构和功能的完整是细胞正常生命活动的前提。缺血缺氧致代谢和能量障碍、炎症、化学毒性攻击等损伤因素均可损伤MT。能量障碍使离子转运失常，形成Ca2+超载。Ca2+超载的危害:(1)刺激ROS过度生成，攻击膜、蛋白质、核酸，致细胞损伤并加重钙超载，形成恶性循环;(2)MT电子传递和ATP生成脱偶联，加重能量障碍;(3)Ca2+和ROS共同作用，在MT内膜形成通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，膜通透性高，造成MT肿胀，ATP耗竭，膜电位降低，引起细胞凋亡和坏死;同时MT外膜形成大孔径的凋亡诱导通道(mitochondrialapoptosis-induced channel，MAC)，CytC经此通道释放到细胞质，与Apaf-1蛋白结合后，再寡聚成凋亡小体，激活Caspase-9，始动凋亡后期Caspases级联反应［9］。(4)直接或间接激活蛋白酶、核酸内切酶，如使细胞结构蛋白、核酸水解，细胞死亡［1］。(5)其它作用:例如Ca2+通过Calpain激活Caspase-12，启动内质网应激凋亡(apoptosis by ER stress)通路，通过促进ROS产生，激活应激致活蛋白激酶JNK信号通路产生凋亡与坏死(TNF-α-死亡受体信号亦参与该通路激活)等［10］。由于Ca2+可通过多种离子通道、转运蛋白、内源储库释放、直接通过损伤的膜等多种途径进入细胞质，Tymianski等认为必须采用多种阻滞药联合应用才能阻断Ca2+内流以保护细胞。

Fig 4 BAPTA-AM blocks the generation of ROS in HepG-2 cells induced by H2O2attack.

BAPTA-AM的优势［11］:(1)目前临床可用的钙拮抗剂只能选择性阻滞Ca2+自某一亚型钙通道内流，并且对已形成的细胞内Ca2+超载无作用，难当抗细胞死亡重任。(2)细胞凋亡、坏死机制复杂，涉及的信号通路和信号分子很多，仅阻断某一环节对改善全局帮助不大。(3)Ca2+超载在多环节参与细胞死亡信号过程。理论上，直接降低［Ca2+］i，迅速消除Ca2+超载，恢复细胞内Ca2+稳态，可在多环节协同产生高效有益作用，是目前最佳可选策略。(4)BAPTA-AM是一种快速高效的细胞内Ca2+络合剂，有效控制［Ca2+］i。是迅速消除Ca2+超载的最佳选择。

基于以上观点，我们致力于BAPTA-AM抗细胞损伤作用的研究，证实其确能多环节抗细胞死亡，结果令人兴奋:(1)BAPTA-AM能有效消除Ca2+超载［11］，抗D-氨基半乳糖所致的肝细胞凋亡与坏死。细胞损伤后，［Ca2+］i明显升高;BAPTA-AM剂量依赖性降低受损细胞［Ca2+］i，浓度为 10－6mol·L－1时使受损细胞［Ca2+］i降低至正常细胞水平。(2)本文工作进一步证明BAPTA-AM可有效保护HepG-2细胞，减轻H2O2攻击所致的细胞活力下降，其机制包括:减少细胞ROS生成;减少MT损伤，维持膜电位;抑制CytC释放而抑制MT凋亡通路的激活;抑制Caspase-9激活。Caspase-9是MT凋亡通路起始物，其活性抑制表明该通路受到抑制。(3)我们有资料(另文发表)表明BAPTA-AM也明显抑制Caspase-8的激活，提示该药也能抑制凋亡的死亡受体通路。动物实验结果支持BAPTA-AM作用的高效性:静脉注射 BAPTA-AM 1-2.5 mg·kg－1，使 D-氨基半乳糖与内毒素(LPS)所致的极性肝衰竭小鼠死亡率大大降低。以上结果相互支持。文献报道［11］BAPTA-AM能抑制H2O2诱导的家兔肾近端小管细胞的死亡，减轻肺主动脉内皮细胞的氧化损伤，抑制Caspase-12和JNK的活化，逆转Cardiotoxin-Ⅲ的细胞毒性，使因大脑中动脉闭塞引起的脑梗死体积减小50.5%，均与本课题组工作一致。BAPTAAM对其它重要信号通路如TNF-α、Bcl蛋白、NF-κb也可能产生影响，我们将作进一步观察。就已有的结果看，BAPTA-AM作为抗细胞死亡、抢救濒危细胞药物，有良好的进一步研发前景。

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