PI3K-Akt-mTOR信号通路对Foxp3基因表达的影响

葛圣林，彭磊磊，张成鑫

(安徽医科大学第一附属医院心脏血管外科，安徽合肥 230022)

调节性T细胞(CD4+CD25+T细胞)是一类具有免疫抑制功能的细胞，在正常机体维持T淋巴细胞动态平衡和免疫耐受机制中扮演重要角色。由于调节性T细胞具有免疫抑制这种特殊功能，可能为抑制免疫排斥反应及诱导免疫耐受开辟一条新的道路，因此受到各国器官移植学家的极大关注。Foxp3是调节性T细胞的特异性功能基因，其在调节性T细胞的表型、发育和功能中起决定性作用［1－2］。Foxp3的调控受多种细胞因子(如 CD28、IL-2、CTLA-4和TGF-β等)及TCR信号的影响，与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白(PI3K-Akt-mTOR)信号通路之间有无联系目前鲜有报道。本实验将研究PI3K-Akt-mTOR信号通路对Foxp3基因表达的影响并探讨两者之间是否具有相关性。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级昆明系小鼠60只，♂性，体重(20±2)g，由安徽医科大学动物中心提供。

1.2主要药物及试剂雷帕霉素(rapamycin，RAPA)购自福建科瑞药业有限公司(产品批号:080601);FITC标记的抗小鼠CD4单克隆抗体及匹配的同型对照(Cat:BM0401，Lot:E033698)，PE 标记的抗小鼠CD25单克隆抗体及匹配的同型对照(Cat:EM2504，Lot:E021463)购自美国 ebioscience公司，兔抗小鼠p-mTOR(S2448)单克隆抗体购自美国Bioworld公司(Cat:BS4706)，免疫组织化学SP法染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TRIzol溶液购自美国 Invitrogen公司(Cat:1401902)，逆转录试剂盒购自美国 Promega公司(Cat:261785)。

1.3主要仪器EPICS XL-MCL(4C)型流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司生产)，Z-300型低速台式离心机(德国HERMLE公司生产)，显微镜(Nikon，ECLIPSE 80i，Japan)，形态学图像分析系统(JEDR 801D)，Tgradient PCR仪(德国Biometra公司生产)。

1.4实验方法将60只小鼠随机分为对照组和实验组，每组15只，饲养在SPF级饲养柜中，饮用水和饲料均经灭菌处理。根据小鼠和人实验剂量换算关系，按照成人的维持治疗剂量2 mg·d－1，实验组(C)每只小鼠灌胃 RAPA 0.4 mg·d－1［3］，实验组(B、D)分别用较低剂量(0.2 mg·d－1)和较高剂量(0.6 mg·d－1)RAPA灌胃，对照组(A)每天予以无菌生理盐水灌胃，共3周。戊巴比妥腹腔注射麻醉，无菌条件下心脏采血，EDTA抗凝，用于流式细胞仪检测;分离脾脏，取1/2研磨，过200目金属滤网，RPMI 1640培养液重新悬浮细胞，制备脾细胞悬液1010·L－1;另 1/2脾脏用于 Foxp3 mRNA RT-PCR及P-mTOR蛋白的测定。

1.5CD4+CD25+T细胞的百分比测定分别取100 μl EDTA抗凝血和脾细胞悬液，加入5 μl FITC标记的抗小鼠CD4单克隆抗体及5 μl PE标记的抗小鼠CD25单克隆抗体，混匀后室温避光孵育30 min，加入溶血剂后室温放置10 min至透明，2 000 r·min－1离心5 min，弃上清，PBS再洗涤2次，加入500 μl PBS混匀，上流式细胞仪检测。同时设立相应的同型对照管。

1.6P-mTOR蛋白的测定及结果评定标准实验步骤严格按照试剂盒说明书操作，石蜡切片经常规脱蜡，梯度酒精水化，0.01 mol·L－1(pH 7.2)枸橼酸盐缓冲液修复抗原，用3%H2O2去离子水室温孵育10 min，PBS液冲洗3次，滴加山羊血清工作液室温孵育30 min后加入一抗(p-mTOR工作液浓度为1∶100)后4℃过夜，PBS液冲洗3次，滴加生物素化二抗工作液后室温孵育30 min，PBS液冲洗3次，DAB显色，自来水充分冲洗，封片，镜检。阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS液代替一抗为标准，其余步骤相同。P-mT0R蛋白主要表达于胞质，阳性染色为浅黄色、棕黄色或棕褐色。采用JEDR 801D形态学图像分析系统对P-mT0R蛋白表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度。以每例5个视野的平均光密度的平均值作为该例的测量值。

1.7Foxp3 mRNA RT-PCR测定取100 mg脾脏组织，用 TRIzol法常规提取淋巴细胞总 RNA，Foxp3 mRNA特异引物做RT-PCR反应，引物由美国Invitrogen公司设计与合成。扩增目的基因在琼脂糖凝胶上电泳，上游物:5'-ACACCCAGGAAAGACAGC-3'，下游引物:5'-CGAACATGCGAGTAAACC-3'，扩增片段592bp。在紫外分析仪上观察结果，同时设Beta-actin作为内参照，扩增片段上游引物:5'-GACCTTCAACACCCCAG-3'，下 游 引 物:5'-GTCACGCACGATTTCCC-3'，扩增片段259bp。凝胶扫描成像系统记录电泳结果。采用Imagemaster VDS(Pharmacia Biotech)图像分析软件分析光密度值，以Foxp3/β-actin光密度比值来表示Foxp3mRNA表达水平。

1.8统计学分析采用SPSS11.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以±s表示。4组间比较采用单因素方差分析，同时采用LSD法进行两两比较;关联分析用Spearman秩相关分析。Foxp3mRNA和p-mTOR蛋白两指标之间用pearson相关分析其是否具有相关性。

2 结果

2.1CD4+CD25+T细胞百分比实验组(B、C、D)小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞水平分别为(9.62±1.43、13.76±1.97、15.41±2.45)%和(12.23±4.56、23.03±6.18、25.17±6.42)%，对照组(A)小鼠外周血和脾细胞中 CD4+CD25+Treg细胞水平分别为(3.52±0.65)%和(6.53±3.01)%，无论是在外周血还是脾细胞中，B、C、D组CD4+CD25+Treg细胞水平明显高于A组(P＜0.05)，C、D组与B组之间CD4+CD25+Treg细胞水平也有差异(P＜0.05)，C组和D组之间CD4+CD25+Treg细胞水平无差异(P＞0.05)，见Tab 1。

Tab 1 Proportion of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood and spleen cells of mice(% ，±s)

Tab 1 Proportion of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood and spleen cells of mice(% ，±s)

In peripheral blood，the comparison among four groups general F=39.971，P=0.000;*P ＜0.05 vs B;#P ＜0.05 vs A.Spearman rank correlation:r=0.749，P ＜0.01In spleen cells，the comparison among four groups general F=30.775，P=0.000.Spearman rank correlation:r=0.762，P ＜0.01

Group Peripheral blood Spleen(A)Normal saline 3.52 ±0.65 6.53 ±3.01(B)RAPA 0.2 mg·d－1 9.62 ±1.43# 12.23 ±4.56#(C)0.4 mg·d－1 13.76 ±1.97*# 23.03 ±6.18*#(D)0.6 mg·d－1 15.41 ±2.45*# 25.17 ±6.42*#

2.2P-mTOR蛋白在脾脏中的表达P-mT0R蛋白的阳性表达主要位于脾细胞胞质，图像分析结果显示，实验组(B、C、D)小鼠脾脏中P-mT0R蛋白表达的平均光密度分别为(0.2326±0.0431、0.1156±0.0223、0.0556±0.0041)，对照组 A 为(0.4223 ±0.0534)，B、C、D组平均光密度均明显低于A组(P＜0.05)，C、D组与B组之间平均光密度也有差异(P＜0.05)，C组和D组之间平均光密度无差异(P＞0.05)，见 Fig 1及 Tab 2。

2.3Foxp3表达实验组(B、C、D)小鼠脾脏中Foxp3/β-actin光密度比值分别为(0.4853±0.0574、0.7886 ±0.1085、0.9639 ±0.2015)，对照组A为(0.1345±0.0271)，见Fig 2及Tab 2。

3 讨论

PI3K-Akt-mTOR信号通路参与细胞增殖、凋亡和分化等多种细胞功能的调节，此信号通路激活后可促进细胞周期运行，使细胞增殖，过度激活可使细胞生存与凋亡失衡，正常细胞发生恶性转化，恶性肿瘤侵袭及转移。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是Akt的下游信号，是调控PI3K/Akt途径的关键因子［4］，在细胞的增殖、分化过程中起着中心调控点的作用［5－6］。mTOR 通过PI3K-Akt途径被Akt直接磷酸化而激活，其磷酸化形式(p-mTOR)是mTOR在PI3K-Akt-mTOR信号通路中的激活状态，研究显示mTOR的ser2448磷酸化，是mTOR信号通路被激活的生物学标志，而总mTOR却不能很好反映mTOR信号通路的激活状态［7－8］，因此本实验选取 p-mTOR(ser2448)蛋白作为研究指标。激活的mTOR随后磷酸化它的两个下游分子(4E-BP1、p70S6K)，使细胞产生生物学效应［9］。雷帕霉素是mTOR的特异抑制剂，RAPA进入细胞后在细胞质中首先与FK506结合蛋白(FKBP)结合形成FKBP12-RAPA复合物，此复合物再与mTOR氨基酸残基2025-2114区结合导致mTOR不能被磷酸化，从而抑制mTOR的生物学功能。研究表明RAPA可以促进CD4+CD25+Treg细胞增长并维持其功能，同时减少 CD4+CD25-效应性 T细胞(effector T cell，Teff)的数量［10－11］，因此深入研究mTOR及其信号通路，可能会为诱导免疫耐受提供新的思路和方法。

Fig 1 Expression of protein p-mTOR in spleen cells of mice

Fig 2 Expression of Foxp3 mRNA in spleen cells of mice

Tab 2 Expression of Foxp3 mRNA and protein p-mTOR in spleen cells of mice(%，±s)

Tab 2 Expression of Foxp3 mRNA and protein p-mTOR in spleen cells of mice(%，±s)

For average optical density of p-mTOR，the comparison among four groups general F=19.875，P=0.000.Spearman rank correlation:r= －0.968，P ＜0.01For the ratio of optical density between Foxp3 and β-ctin，the comparison among four groups general F=12.139，P=0.000;#P ＜0.05 vs A:*P ＜0.05 vs B.Spearman rank correlation:r=0.868，P ＜0.01Two index about average optical of p-mTOR and the ratio of optical density between Foxp3 and β-actin were analysized by Pearson rank correlation:r= －0.993，P＜0.01

Group Foxp3/β-actin Average optical density of p-mTOR(A)Normal saline 0.1345 ±0.0271 0.4223 ±0.0534(B)RAPA 0.2 mg·d －1 0.4853 ±0.0574# 0.2326 ±0.0431#(C)0.4 mg·d －1 0.7886 ±0.1085#*0.1156 ±0.0223#*(D)0.6 mg·d －1 0.9639 ±0.2015#*0.0556 ±0.0041#*

本实验结果发现，在RAPA 3种使用剂量情况下，随着RAPA使用剂量逐步加大，p-mTOR的阳性率逐渐降低，说明PI3K-Akt-mTOR信号通路不同程度地被RAPA所抑制;同时，Foxp3 mRNA的表达也不同程度地增强，CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比逐渐增高。对外周血及脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞水平均进行Spearman秩相关分析，结果显示CD4+CD25+Treg细胞水平与RAPA给药剂量呈正相关(外周血组:r=0.749，P＜0.01;脾细胞组:r=0.762，P＜0.01)，说明在一定的RAPA给药剂量范围内可以通过增加其给药剂量来提高CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比。虽然C组和D组之间无差异，但D组较C组也有增高的趋势，可能在进一步增大RAPA的给药剂量后就会表现出差异。通过对Foxp3mRNA和p-mTOR蛋白两指标(Foxp3/β-actin光密度比值及平均光密度)之间相关性分析发现二者之间存在负相关(r=－0.993，P＜0.01)，p-mTOR蛋白表达的平均光密度随着雷帕霉素用量的增加而降低说明PI3K-AktmTOR信号通路被逐步的抑制，尔后Foxp3mRNA的表达逐渐增强，由此我们可以推出抑制PI3K-AktmTOR信号通路可以使Foxp3的表达增强，且Foxp3的表达程度与PI3K-Akt-mTOR信号通路的激活程度呈负相关。

在以往的研究中，人们逐渐发现mTOR信号通路在调控天然免疫和适应性免疫反应中起着重要作用。虽然抑制mTOR在一些免疫抑制试验计划中得到开发，但RAPA在体内的免疫抑制机制仍然不明确。目前，科学家已对PI3K-Akt-mTOR信号通路和Treg细胞生长分化之间的关系给出自己的观点，Feuerer等［12］认为激活 PI3K-Akt-mTOR信号通路会抑制 Treg细胞的分化，Strauss等［13］也认为 PI3KAkt-mTOR信号通路在CD4+Foxp3+Treg细胞生长分化中起着重要作用。通过本实验可发现抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路会促使CD4+CD25+Treg细胞特异性基因Foxp3的表达增强，最终影响小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞含量的不同，这为我们进一步研究RAPA诱导Foxp3表达的具体机制提供了一条新的思路，此外mTOR已经被确定是PI3KAkt的下游靶点，抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路的这一成分，对于我们在临床工作中诱导免疫耐受也具有积极意义。

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