新疆棉花秸秆中乳酸菌的分离与鉴定

张永辉 严 萍 阿布都克尤木·麦麦提 麦热姆妮萨·艾麦尔 樊 振 乌斯满·依米提

新疆是中国产棉大区，多年来棉花种植面积占到全国的1/3，种植面积达2000多万亩，棉花总产量200多万吨。棉秆年均产量为540万吨。棉秆除一部分用于还田外，大多数被用作柴禾。开发利用棉秆资源,是提高棉田经济效益的有效途径之一。

许国英等(1998)[1]对棉花秸秆营养成分进行了测得,棉秆中的粗蛋白含量为9.96%，优于稻草、麦秸；粗纤维含量为32.15%；木质素含量为36.2%，比其它主要农作物含量高2.5～3倍。但由于在自然状态下的棉秆粗蛋白含量低而粗纤维含量高，因此消化率低、适口性差，农户普遍很少喂养家畜。只有通过青贮、氨化等方法处理，才能解决这一问题[2]。而添加乳酸菌青贮是目前研究的热点，牧草上天然附着的乳酸菌在青贮发酵过程中起着非常重要的作用。本研究以新疆吐鲁番地区棉花秸秆为实验对象，采用传统生理生化和16S rRNA相结合的方法，分离出4珠乳酸菌，并从中筛选出优良乳酸菌，为进一步以棉花秸秆为原料制作青贮饲料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

2009年10月采集新疆吐鲁番地区棉花秸秆样品。

1.1.2 培养基与试剂

MRS+CaCO3琼脂培养基、MRS液体培养基、糖类发酵基础培养基等，参照杨洁彬(1991)、凌代文(1999)、东秀珠(2001)的方法配制。

1.1.3 设备

GMSX-280型手提式压力蒸气消毒器：北京市永光明医疗仪器厂生产；ISO900型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司生产；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司生产；GXZ型智能光照培养箱：宁波江南仪器厂制造；PHS-501精密酸度计：上海鹏顺科学仪器有限公司生产；Perkin Elmer CeneAmp 9600 PCR仪：北京北加美因生物技术有限公司生产；DYCP-31C型琼脂糖电泳仪：北京市六一仪器厂生产。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化

取棉花秸秆30 g，装入盛有220 ml 0.9%灭菌生理盐水的三角瓶内，充分搅拌，将此溶液稀释到10-2～10-7倍，取 10-4、10-5、10-6和 10-74 个稀释度，将稀释后的悬液涂布在MRS+CaCO3平板上，培养条件为30℃，72 h。根据菌落的颜色、大小、光泽、是否有透明圈，挑取单菌落，多次划线分离纯化后，进行革兰氏染色、镜检观察菌体大小、形状及排列方式。将纯菌接种到MRS液体培养基中，培养48 h后（悬液：30%液体石蜡=1：1）4℃的冰箱保存备用。

1.2.2 乳酸菌属种的鉴定

凡是革兰氏染色阳性、过氧化酶阴性的菌株初步定为乳酸菌[5]，乳酸菌的生理生化试验参照相关杨洁彬(1991)、凌代文(1999)、东秀珠(2001)方法，确定属。

1.2.3 16S rRNA基因序列同源性分析

将分离的乳酸菌菌株，采用CTAB法提取基因组DNA[6-7]，采用正向引物27f:5-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3，反向引物1492R:5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，进行PCR扩增[8]，扩增条件：PCR反应条件为:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度正确的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。测序结果通过http://www.ncbi.nih.nlm.gov网站用BLAST进行序列同源性比对，然后在GenBank注册序列号。用MEGA4.0的Neighbor-Joining[9]法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验。

1.2.4 乳酸菌产酸试验

将分离并鉴定的4株乳酸菌分别按5%的接种量接入MRS液体培养基中，37℃恒温培养。每隔2 h测定不同菌株发酵液pH值并绘制产酸速率曲线。

2 结果与分析

2.1 菌落特征及个体形状

初步分离出菌株13株。经革兰氏染色镜检、过氧化氢酶反应得到革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性符合乳酸菌特征的菌株 4 株, 编号为 Z1、Z2、Z4、Z5，进一步在MRS平板上观察菌落形态，结果见表1。

表1 乳酸菌的形态特征

经过菌体菌落形态观察、革兰氏染色、过氧化氢酶等试验，表明有4株菌为乳酸菌，其中菌株Z1、Z2革兰氏阳性，圆球形，对生，菌落为乳白色，扁平，表面光滑，菌落周围具有透明圈。Z4、Z5革兰氏阳性，短杆状，单个或呈链状排列，菌落为乳白色，中央凸起，表面光滑，菌落周围具有透明圈。

2.2 乳酸菌鉴定结果

对分离得到的纯菌株进行部分生理生化试验鉴定，结果见表2。

将分离的4株乳酸菌进行部分生理生化实验，结果表明：均为革兰氏染色阳性，不运动，在H2O2酶实验、H2S实验、明胶液化实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产气实验呈阴性。其中Z1、Z2在15℃、45℃，pH值4.5，6.5%NaCl生长良好，不发酵乳糖和蔗糖。结合形态特征，初步定为片球菌属。Z4、Z5在15℃，pH值4.5生长，在45℃，6.5%NaCl不生长。结合形态特征，初步定为乳杆菌属。

2.3 序列分析和系统发育树的构建

表2 乳酸菌属的鉴定结果

16S rRNA基因序列分析显示，菌株Z1(HQ589248)的16S rRNA基因序列长度为1407 bp核苷酸，菌株Z2(HQ589249)的16S rRNA基因序列长度为1377 bp核苷酸，菌株Z4(HQ589250)的16S rRNA基因序列长度为1372 bp核苷酸，菌株Z5(HQ589251)的16S rRNA基因序列长度为1390 bp核苷酸。与从GenBank中相关乳酸菌菌种的16S rRNA基因序列进行比较，并用MEGA4.0的Neighbor－Joining法构建系统发育树。结果见图1。菌株Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)与 Pediococcus pentosaceus(AJ305321)的相似性为99%。菌株 Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)与 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum(ACGZ01000098)的相似性为100%。一般来讲，在种分类等级上，如果2个分类单位间的16S rRNA序列同源性大于97.5%，则认为属于同一个种[10－11]。因此，将 Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)鉴定为戊糖片球菌，将Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)鉴定为植物乳杆菌。

图1 分离乳酸菌菌株16S rRNA基因序列建立的系统发育树

2.4 产酸速率测定结果(见图2)

图2 37℃发酵过程中pH值的变化

由图2可以看出，4株菌接种2～6 h内菌株发酵液的pH值迅速下降，6～14 h pH值下降缓慢，并且都有较强的产酸能力，6 h后pH值都能达到4.0以下，其中戊糖片球菌中Z2的产酸能力较强，14 h pH值就能达到3.5；植物乳杆菌中Z5的产酸能力较强，14 h pH值就能达到3.48。在青贮饲料的制备过程中pH值的快速降低能够显著抑制青贮原料中的有害微生物，如酵母、霉菌等，从而提高青贮饲料的品质。因此菌株Z2和Z5可被用作以棉花秸秆为原料的青贮饲料添加剂。

3 结论

3.1 从新疆吐鲁番地区棉花秸秆中分离得到Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)、Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)4株菌，根据形态特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析，参阅《伯杰士细菌学手册》(第九版)及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》鉴定为Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)为戊糖片球菌，Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)为植物乳杆菌。

3.2 对已鉴定的乳酸菌进行产酸速率试验，4株菌都有较强的产酸能力，戊糖片球菌中Z2菌株的产酸能力较强，14 h pH值就能达到3.5。植物乳杆菌中Z5菌株的产酸能力较强，14 h pH值就能达到3.48。可用作以棉花秸秆为原料的青贮饲料添加剂。

3.3 青贮是在厌氧条件下，通过附生于植物体的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，厌氧发酵产生有机酸(主要是乳酸)，导致pH值降低，从而杀灭各种微生物或抑制其繁衍，达到保存青绿饲料的目的(Mc－Donald等，1991)。然而由于自然界牧草上存在的乳酸菌含量少，仅占细菌总数的0.01%～1%,所以在发酵过程中乳酸菌很难迅速的形成优势菌群，不能在短时间内降低pH值，青贮的效果得不到明显的改善。因此，正确选择青贮添加剂在很大程度上对畜牧业的发展起到促进作用。接种剂中的乳酸菌通常是从作物或青贮料中筛选出来的，之所以被选择是因为其繁殖迅速，并且是同型发酵。由于它们是自然界中的同型发酵菌，一般认为它们将对青贮质量产生积极的影响。实验从新疆吐鲁番地区棉花秸秆中分离的4株乳酸菌，来源于棉花秸秆，更容易适应青贮发酵环境。本实验室将进一步以这两株菌作为添加剂来制备以棉花秸秆为原料的青贮饲料，研究这两株菌对棉花秸秆青贮发酵品质的影响，为充分利用新疆棉花秸秆、发展畜牧业提供理论依据。

[1]许国英,热合木都拉,马英杰.棉花秸秆的饲用价值研究[J].新疆畜牧业,1998(3):10-11.

[2]吴杰.新疆棉花秸秆利用现状分析和探讨[J].中国棉花,2006,33(2):9-11.

[3]杨洁彬,郭兴华,凌代文.乳酸菌生物学基础及应用[M].北京:中国轻工业出版社，1991:1-3.

[4]凌代文.乳酸菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999:1-25.

[5]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[6]奥斯伯F,布伦特R,颜子颖译.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,1998.

[7]Wilson K.Preparation of genomic DNA from bacteria[C]//Ausubulf M，Bent R.Current protocols in molecular biology.New York:Wiley and Sons,1987.

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[9]Sudhir K,Koichiro T,Ingr//D B J,et al.molecular evolutionary genetics analysis software[J].Bioinformatics,2001，17:1244-1245.

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