高效液相色谱法测定成都市售蔬菜黄酮含量

李长洲，赖升凤，向涵，许宁，王文楠，彭晓莉，余小平

（成都医学院公共卫生系，四川 成都 610083）

黄酮具有去除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤和防治心血管疾病等生物学效应［1］。已有研究报道蔬菜中黄酮含量丰富［2－5］，但蔬菜生长的土壤和气候条件可影响蔬菜中的黄酮含量［6］。本研究在建立高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定黄酮含量的基础上，检测了成都市售8种蔬菜中黄酮含量。

1 材料与方法

1.1 材料

8种蔬菜（茄子、苦瓜、洋葱、芹菜叶、芹菜茎、韭菜、胡萝卜、玉米）来自成都地区市售。芦丁标准品购自成都瑞芬思生物科技有限公司；石油醚（沸程30～60℃，分析纯）购自成都市科龙化工试剂厂。甲醇、乙腈（色谱纯）分别购自美国Sigma公司和TEDIA公司。

高效液相色谱仪由天美科技有限公司提供；检测器 UV Detector L－2400、泵 L－2130、电子天平由北京赛多利斯系统有限公司提供；DZKE－4型电子恒温水浴锅由黄骅市渤海电器厂提供；DHG－9053A型鼓风干燥箱由上海一恒科技有限公司提供；FY－135型号粉碎机由天津泰斯特仪器有限公司提供；60目标准筛由浙江省上于筛具总厂提供。

1.2 实验方法

1.2.1 蔬菜处理 将8种蔬菜去枯叶洗净，鼓风干燥箱40℃将其烘干，粉碎后过60目标准筛，粉末置入30℃石油醚中脱脂8h，室温干燥后备用。

1.2.2 黄酮提取液制备和黄酮的测定 准确称取蔬菜粉末样品0.5g，加入10ml甲醇溶液，放入超声仪，重复2次，然后将滤液混合，即为黄酮提取液。HPCL测定后参照文献［7］的方法计算黄酮含量：黄酮含量（mg／100g）＝（V·C·n／W）×100。其中，V为试样定容量（ml），C为查得标准曲线样品液的黄酮含量（mg／ml），n为稀释倍数，W 为试样重（g）。

1.2.3 标准品溶液制备 精确称取芦丁标准品0.5mg，置于10ml量瓶中，加甲醇定容到5ml，摇匀即得1mg／ml质量浓度的溶液，分别取0.10，0.25，0.50，1.00，2.00ml置于10ml量瓶中加甲醇定容到10ml可得含量为0.010、0.025、0.050、0.100、0.200mg／ml的标准品溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Allsphere ODS－2Su C18（4.6mm×150mm，5μm）柱，流动相 A（乙腈）：流动相B（水）＝60∶40（体积比），流速1ml／min，进样量10μl；检测波长320nm［8］，柱温为25℃。色谱图见图1，2。图1为芦丁标准品色谱峰图，保留时间为2.153 min；图2为芹菜叶色谱峰图，测定结果表明芹菜中所测得的为黄酮类物质。

图1 芦丁标准品HPLC色谱峰图Fig.1 The chromatographic of rutin

2 结果与分析

2.1 标准曲线与线性范围

将不同浓度的标准品溶液依次进样，进样量10μl，分别重复3次，以标准品溶液浓度的自然对数为横坐标（X），峰面积的自然对数为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程。芦丁标准品回归方程为Y＝7617X＋3785.5，r2＝0.999，黄酮含量在0.02～0.2mg／ml之间的线性关系良好。

2.2 精密度试验

以0.025mg／ml芦丁标准溶液进行精密度试验，进样量10μl，重复5次，测得峰面积分别为3975.4、3991.2、3957.5、3962.0、3987.9，RSD＝0.90%。峰面积相对标准偏差为0.90%.结果显示0.025mg／ml芦丁的精密度良好。

2.3 重复性试验

准确称取粉末样品5份，按照1.2.2的方法制备黄酮提取液，在前述色谱条件下分别测得茄子、苦瓜、洋葱、芹菜叶、芹菜茎、韭菜、胡萝卜、玉米中黄酮的RSD 分别为 1.64%、1.25%、0.98%、0.57%、0.61%、0.74%、1.13%、0.80%（n＝5），显示 HPLC测定黄酮的重复性良好。

2.4 回收率试验

选择芹菜叶作为回收率试验的样品。取已查标准曲线芹菜叶黄酮含量的提取液3份，各加入同体积0.025mg／ml芦丁标准液，与未添加芦丁标准液的同一芹菜叶样品进行比较，其回收率分别为98.2%、101.1%、98.7%，平均回收率99.3%，RSD为1.22%。结果表明HPLC法测定黄酮的回收率良好。

2.5 常见新鲜蔬菜的黄酮含量

准确称取各待测蔬菜5份，按照1.2.2的方法制备黄酮提取液，利用建立的HPLC法分别测得茄子、苦瓜、洋葱、芹菜叶、芹菜茎、韭菜、胡萝卜、玉米中黄酮含量，计算得各蔬菜黄酮含量，结果见表2。由表2可见，芹菜和韭菜中黄酮含量较高，芹菜叶黄酮含量高于芹菜茎。

3 讨论

本实验采用色谱柱为Allsphere ODS－2Su C18柱，流动相为乙腈和水（60：40），流速1ml／min，柱温为25℃，进样量10μl，检测波长320nm。0.02～0.2mg／ml范围内呈良好的线性关系（r2＝0.999），平均回收率99.3%（RSD＝1.22%）。黄酮液相检测条件下，物质分离效果较好，在芦丁保留时间前后无其他峰显现，芹菜的物质成分达到很好的分离，表明在此液相色谱条件下，能完成对蔬菜中黄酮含量的准确有效的检测。本实验待测8种蔬菜均含有黄酮类物质，不同品种的蔬菜黄酮相差较大。芹菜和韭菜中黄酮含量较高，芹菜叶黄酮含量高于芹菜茎。

表1 常见新鲜蔬菜蔬菜黄酮含量Tab.1 The contents of flavonoids in common fresh vegetables

黄酮类化合物广泛分布在蔬菜中，不同季节或地区产的同种蔬菜中黄酮含量不同［6］，食物的品种、生长环境等多种因素对蔬菜中类黄酮的分布和含量影响很大。陆广念等［7］对扬州市售16种蔬菜抗氧化活性与黄酮含量进行测定，16种蔬菜均测出黄酮成分，不同品种黄酮含量差异也较大，含量在101.953～5.162mg／100g之间，黄酮含量与抗氧化能力存在一定的相关性。

另有文献报道了蔬菜中黄酮物质的具体成分。徐静等［8］测定天津市售常见30种蔬菜中槲皮素、杨梅黄酮、坎二菲醇和芹菜配基的含量，30种蔬菜中29种检测出了槲皮素，含量在7.55～0.60mg／100 g鲜重范围，5种检测出芹菜配基，7种检测出玉米黄酮，8种检测出杨梅黄酮，坎二菲醇在30种蔬菜中均未检出；藕、洋葱、豆角、西红柿、芹菜等蔬菜中类黄酮含量较高。曹杰等［3］测定哈尔滨市售蔬菜水果中芹菜素、山奈酚、槲皮素、异鼠李黄素和毛地黄黄酮5种黄酮物质，芹菜叶中芹菜素含量较高，为84.18mg／100g；洋葱槲皮素1.72mg／100g，山奈酚1.34mg／100g；西红柿槲皮素为1.56mg／100 g，其他黄酮物质未检测出。本实验中测得芹菜叶黄酮含量为121.23mg／100g，与其结果相近，芹菜叶中芹菜素是主要的黄酮类物质。

芹菜叶的黄酮含量较高，在烹调中弃之可惜。在日常生活可充分利用，将芹菜叶加工成可口的菜肴，如芹菜叶肉馅饺子、芹菜叶煎鸡蛋、芹菜叶拌香干、芹菜叶蛋汤等都是既营养又可口的吃法。

［1］白凤梅，蔡同一.类黄酮生物活性及其机理的研究进展［J］.食品科学，1999，（8）：11－13.

［2］Block G，Patterson B，Subar A.Fruit，vegetable，and cancer prevention：a review of epidemiological evidence［J］.Nutr Cancer，1992，18（1）：1－29.

［3］曹杰，赵秀娟，吴坤，等.高效液相色谱法同时测定蔬菜水果中5种黄酮类化合物［J］.预防医学情报杂志，2008，24（7）：525－527.

［4］李荣华，夏薇，吴坤.蔬菜中芹菜素高效液相色谱测定［J］.中国公共卫生，2007，23（7）：894－895.

［5］祁英，丁江涛，苏景秀，等.洋葱中黄酮类化合物的分布及其抗氧化活性的研究［J］.中国食物与营养，2010，5：67－71.

［6］Quan HJ，Koyanagi J，Ohmori K，et al.Preparati ons of heterosp irostanols and their pharmaeological activities［J］.Eur J Med Chem，2002，37（8）：659－669.

［7］陆广念，宋晓敏，谭甜甜.扬州市售蔬菜抗氧化活性与黄酮含量分析［J］.扬州大学烹饪学报，2010，127（1）：46－54.

［8］徐静，郭长江，韦京豫，等.蔬菜中类黄酮物质的高效液相色谱测定法［J］.营养学报，2005，27（4）：276－279.