表没食子儿茶素没食子酸酯对容积超负荷导致的大鼠心肌肥厚的改善作用

贾皓，余小平，程道梅，彭晓莉

（成都医学院公共卫生系，四川 成都 610083）

心肌肥厚是心脏应对血液动力超负载而发生的一种代偿机制［1］，尽管心肌细胞的肥厚在初期可以补偿一定程度的心脏功能的缺失，但长期持续的心肌肥厚最终会导致扩张型心肌病、心力衰竭甚至猝死［2，3］。

流行病学研究显示，绿茶提取物中的多酚类等天然抗氧化剂可以降低冠心病的死亡率［4］。作为绿茶提取物中重要的茶多酚的一种，表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocathechin－3Gallate，EGCG）被报道具有心血管系统的保护效应。EGCG通过阻断氨基端激酶（JNKs）信号通路从而抑制了Angiotensin II诱导的血管平滑肌细胞的肥厚［5］，但EGCG针对心肌肥厚的效果的报道却较为罕见。故而在本研究中，我们采用经口给药的方式，探究EGCG对于容积超负荷诱发的心肌肥厚的预防效果。

1 材料与方法

1.1 实验设计

在实验期间，EGCG被连续的供给各实验组，然而对照组被提供相同的不含EGCG的饮用水。具体设计如下（图1）。

1.2 活体心肌肥厚模型

Spregue－Dawley大鼠麻醉后，实施开腹手术，暴露出腹主动脉与腔静脉，将一支18G的针头插入主动脉内，然后从动脉的内侧壁贯穿入腔静脉，通过同一路径反复贯穿几次，以确保贯穿通路的尺寸。腹部动脉针头插入的位置采用氰基丙烯酸盐粘合剂重新封起后，缝合大鼠的腹部。

1.3 离体心脏缺血／复灌（I／R）模型制备

大鼠称重断头后开胸取出心脏，迅速转移，固定于Langendorff灌流装置，以95%O2＋5%CO2混合气体饱和的K－H液，行76mm Hg（1mmHg＝0.133kPa）恒压灌流，用6－0医用无损伤缝合线穿过冠状动脉左前降支以备结扎。各组大鼠心脏稳定20min后进行实验处理，给药后用缝合线结扎冠脉（观察心外膜电图，以结扎后出现明显R波高耸或ST段抬高为冠状动脉结扎成功的标准），行缺血30min，再松开缝合线进行复灌（观察心外膜电图，以松开缝合线后出现抬高的ST段下降50%以上为复灌成功的标准）15min。缺血及复灌期间如出现不可逆心室颤动则不纳入样本。

1.4 标本的采集和处理

各组大鼠按照设定时间点进行取材，切取心脏组织视交叉前后各2mm厚的心脏组织，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）中固定24h后，进行石蜡包埋。将包埋好的脑组织蜡块进行连续切片，60%烤箱内烤片1h进行固定，进行药木精－伊红（HE）染色，常规显微镜观察。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间差异采用单因素ANOVA方法分析，若方差具齐性则用LSD检验，若方差不具齐性则用Tamhane s T2检验，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 容积超负载模型的确认

在ACS实施后1d分别测定各组的中心静脉压（central venous pressure，CVP）与左心室射血分数 （left ventricular end－diastolic pressure，LVEDP），ACS组的CVP与LVEDP明显增高，这充分说明了ACS手术增加了心脏在舒张末期的心室内的血容量，从而加重了室壁的压力（图2）。

2.2 EGCG对超负荷导致的心脏质量的变化的影响效果

通过每天对水的摄取量的测量发现，sham与ACS组并无明显差异，但在 HW／BW 比率方面，ACS组相对于sham组增加了58%，而这份增加在EGCG组减小到了10.8%。在LW／BW及BW方面，ACS与EGCG组没有显著差异。这些结果与以往的关于EGCG对机体肝脏等其他组织器官无毒性的结论是相一致的［26］。这些结果显示了EGCG对容积超负荷导致的心肌肥厚有明显的抑制作用（图3）。

2.3 EGCG对心脏组织及心肌细胞的形态改变的影响效果

研究表明，与sham组比较，ACS组均明显增加了心脏组织的体积及心肌细胞的面积。而这种容积超负荷导致的增大几乎被EGCG完全抑制（图4）。

2.4 EGCG对容积超负荷大鼠心脏的缺血再灌损伤的影响效果

在本研究中，我们还通过心脏离体灌注体系，检测了EGCG对于心机能的影响（图5）。结果表明，与ACS组比较，EGCG组明显提高了缺血后的大鼠的心机能（图5A）。在整个再灌过程中，与ACS组比较，LVEDP和冠脉血流量都得到了明显的改善（图5B，5C）。这些都显示EGCG明显改善了肥厚心肌的缺血再灌损伤。

3 讨论

本研究首次体内探讨了EGCG关于容积超负荷导致的心肌肥厚的生物学效应。基于本研究的数据，我们有理由相信EGCG具有作为有疗效的心肌肥厚防治药物开发的潜质。本研究还进一步证明了EGCG不仅具有抑制心肌肥厚的效果，而且EGCG对心肌缺血再灌的损伤也有明显的改善作用。

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）已经在很多细胞中被证明是一个重要的应激反应的细胞内信号分子，会导致细胞凋亡、增殖等细胞行为。在离体心肌细胞肥厚实验模型中，ROS被证明与心肌肥大有关联［11］，并且可以调节机械拉伸、Angiotensin II及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）诱导的心肌肥厚［12－14］。EGCG 已经被证明具有强效的抗氧化活性［15］，所以我们可以认为抗氧化效应是包含在EGCG预防容积超负荷导致的心肌肥厚的信号转导途径中的。

肾素－血管紧张素系统（RAS）同样被报道在多种器官肥大的信号传导途径中扮演着重要的角色［16］。交感神经和全身肾素一血管紧张素系统在容积超负荷之后被报道发现活化［17］。然而，在离体培养的心肌细胞中，EGCG能够抑制血管紧张素2调节的信号转导［18］，所以，本研究中的EGCG的抗肥厚效果也有可能是通过阻断RAS的作用而实现的，类似的结果也曾在其他几种动物模型中被证实［19，20］。所以，有必要深入探讨EGCG的抗心肌肥厚的机理的研究。

心肌肥厚是针对于增加的室壁压力的一种代偿性反应，对心肌细胞肥厚的抑制可能会导致一定程度的心力衰竭。所以在长期的超负荷心脏中，为保持心肌功能在正常范围内被认为是心肌肥厚的主要机制［21］。有报道说，Cyclosporine A处理后，能够抑制血压超负荷心肌肥厚，保持心机能在正常范围内［22］。另一些研究表明心肌细胞肥厚与收缩障碍是相关联的，这一关联进而增加了缺血再灌的损害［23，24］。我们通过检测容积超负荷心脏在缺血再灌伤害后的心机能的恢复，从而明确了EGCG也具有心机能的维护效果，EGCG不仅有效抑制了心肌肥厚而且明显改善了容积超负荷心脏的缺血再灌后的心机能的恢复。这个结果显示了EGCG使心肌在未肥厚的状态下适应了容积超负荷。

众所周知，Cyclosporine A与FK506等磷酸酶抑制剂具有抑制心肌肥厚的效果，但同时也兼有肾毒性与免疫抑制等副作用，从而限制了这类药物的治疗效果［25］。在本研究中，EGCG不仅抑制了容积超负荷导致的心肌肥厚及心肌细胞形态变化的效果，而且对正常心脏及肝脏无明显影响，也没有任何关于正常成长、体重增加及体力活动方面的影响，因为患者大部分在确诊的时候已经形成了心肌肥厚，所以更进一步的研究有必要集中在EGCG是否可以逆转已经形成的心肌肥厚，这将是更具有临床的实际意义的研究。

总之，本研究证明了EGCG可以抑制容积超负荷导致的心肌肥厚及改善心机能。这些发现也许能带来重要的关于预防心肌肥厚到心力衰竭转变的新的临床治疗策略的暗示。

［1］Wang X，Ren B，Liu S，et al.Characterization of cardiac hypertrophy and heart failure due to volume overload in the rat［J］.J Appl Physiol，2003，94（2）：752－763.

［2］Hasenfuss G.Animal models of human cardiovascular disease，heart failure and hypertrophy［J］.Cardiovasc Res，1998，39（3）：60－76.

［3］Hunter JJ，Chien KR.Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure［J］.N Engl.J Med，1999，341（11）：1276－1283.

［4］Duarte J，Perez－Vizcaino F，Utrrilla MP，et al.Vasodilatory effects of flavonoids in rat aortic smooth muscle.Structureactivity relationships［J］.Gen Pharmacol，1993，24（10）：857－864.

［5］Zou Y，Komuro I，Yamazaki T，et al.Cell type－specific angiotensin II－evoked signal transduction pathways：critical roles of Gβγsubunit，Src family，and Ras in cardiac fibroblasts［J］.Circ Res，1998，82（3）：337－345.

［6］Siwik DA，Tzortzis JD，Pimental DR，et al.Inhibition of copper－zinc superoxide dismutase induces cell growth，hypertrophic phenotype，and apoptosis in neonatal rat cardiac myocytes in vitro［J］.Circ Res，1999，85（2）：147－153.

［7］Pimentel DR，Amin JK，Xiao L，et al.Reactive oxygen species mediate amplitude－dependent hypertrophic and apoptotic responses to mechanical stretch in cardiac myocytes［J］.Circ Res，2001，89（14）：453－460.

［8］Nakamura K，Fushimi K，Kouchi H，et al.Inhibitory effects of antioxidants on neonatal rat cardiac myocyte hypertrophy induced by tumor necrosis factor－αand angiotensin II［J］.Circulation，1998，98（9）：794－799.

［9］Higuchi Y，Otsu K，Nishida K，et al.Involvement of reactive oxygen species－mediated NF－κB activation in TNF－α－induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.J Mol Cell Cardiol，2002：34（17）：233－240.

［10］Nagai K，Jiang MH，Hada J，et al.（－）－Epigallocatechin gallate protects against NO stress－induced neuronal damage after ischemia by acting as an anti－oxidant［J］.Brain Res，2002，956（2）：319－322.

［11］Ruzicka M，Yuan B，Harmsen E，et al.The renin－angiotensin system and volume overload－induced cardiac hypertrophy in rats.Effects of angiotensin converting enzyme inhibitor versus angiotensin II receptor blocker［J］.Circulation，1993，87（3）：921－930.

［12］Willenbrock R，Stauss H，Scheuermann M，et al.Effect of chronic volume overload on baroreflex control of heart rate and sympathetic nerve activity［J］.Am J Physiol，1997，273（2）：2580－2585.

［13］Zheng Y，Song HJ，Kim CH，et al.Inhibitory effect of epigallocatechin 3－O－gallate on vascular smooth muscle cell hypertrophy induced by angiotensin II［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2004，43（2）：200－208.

［14］Priyadarshi S，Valentine B，Han C，et al.Effect of green tea extract on cardiac hypertrophy following 5／6nephrectomy in the rat［J］.Kidney Int，2003，63（5）：1785－1790.

［15］Li HL，Huang Y，Zhang CN，et al.Epigallocathechin－3gallate inhibits cardiac hypertrophy through blocking reactive oxidative speciesdependent and－independent signal pathways［J］.Free Radic.Biol Med，2006，40（10）：1756－1775.

［16］Esposito G，Rapacciuolo A，Naga Prasad SV，et al.Genetic alterations that inhibit in vivo pressure－overload hypertrophy prevent cardiac dysfunction despite increased wall stress［J］.Circulation，2002，105（8）：85－92.

［17］Hill JA，Karimi M，Kutschke，et al.Cardiac hypertrophy is not a required compensatory response to shortterm pressure overload［J］.Circulation，2000，101（24）：2863－2869.

［18］Friehs I，Moran AM，Stamm C，et al.Promoting angiogenesis protects severely hypertrophied hearts from ischemic injury［J］.Ann Thorac Surg，2004，77（6）：2004－2010.

［19］Chung Y.Oxygen reperfusion is limited in the postischemic hypertrophic myocardium［J］.Am J Physiol Heart Circ.Physiol，2006，290（5）：2075－2084.

［20］Ventura HO，Malik FS，Mehra MR，et al.Mechanisms of hypertension in cardiac transplantation and the role of cyclosporine［J］.Curr Opin Cardiol，1997，12（4）：375－381.

［21］Kao YH，Hiipakka RA，Liao S.Modulation of endocrine systems and food intake by green tea epigallocatechin－gallate［J］.Endocrinology，2000，141（22）：980－987.