Zhangfei在小鼠动情周期卵巢和子宫中的分布＊

乔海娇，林鹏飞，王爱华

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100）

Zhangfei（ZF）又称为 CREBZF，属于 CREB（cAMP－response－element－binding protein）／ATF（activating transcription factor）家族成员之一，是目前发现的第2个能够与单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus－1，HSV－1）相关联的宿主细胞因子1（host cell factor 1，HCF－1）相互作用的碱性亮氨酸拉链（basic region－leucine zipper，bZIP）转录因子［1］。与大多bZIP不同的是，ZF不能以同型二聚体的 形 式 与 DNA 相 结 合［1－2］。 但 是 ZF 能 够 与VP16［3］、Luman［4］、ATF4［5］以 及trkA［6］等 形 成 异型二聚体，从而正调控或者负调控下游基因的表达。目前的研究认为ZF不能作为同型二聚体结合到DNA的主要原因是在其结构的NxxAAxxCR区缺乏一个关键的天冬氨酸残基［1－3］。

至今ZF的具体生物学功能还不是十分清楚。它以一种类似于Luman和转录激活因子VP16相结合的方式与 HCF－1相结合，抑制了VP16－HCF－1－Oct－1复合体的形成，从而阻止了HSV－1立即早期（IE）基因的表达［3］。ZF能够有效地和 HCF－1结合，推测其可能在细胞的增殖和分化中起着一个很重要的作用。ZF和ATF4形成的异型二聚体在哺乳动物的未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）中起着很重要的作用［5－7］。同时，ZF以依赖HCF－1的方式抑制Luman的表达［4］，而Luman是内质网应激时的一个关键因子［8］。现有的研究表明，内质网应激与哺乳动物胚胎和胎儿的正常发育有着密切的关系［9－11］。由此可见，ZF不但参与内质网应激和未折叠蛋白反应调节，其在胚胎发育、人类疾病等生理和病理过程中也具有重要的意义。目前，国内外尚未见ZF在生殖内分泌领域相关研究的报道。为此，本试验采用免疫组织化学方法观察了ZF蛋白在不同动情周期小鼠卵巢与子宫中的分布规律，为进一步探讨ZF的生物学功能提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用20只8周龄±10周龄的雌性昆明小鼠，购于第四军医大学实验动物中心，室温、自然光照、自由进食饮水和笼养方式饲养。适应性饲养1周～2周，采用阴道涂片法对小鼠动情周期进行观察与判断，选择连续2个周期正常者用于试验。

1.1.2 主要试剂 小鼠免疫组化检测试剂盒为北京四正柏生物科技有限公司产品，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。鼠抗ZF的克隆抗体由农业部动物生物技术实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠发情周期的确定 将小鼠保定，提起尾巴暴露阴道口，观察外阴特征并记录。右手持滴管吸少量生理盐水滴入阴道口，稍放松尾部及腰部，生理盐水被吸入阴道，稍候，用滴管吸出液体，滴到载玻片上。待稍干后用酒精（950mL／L）固定5min，然后用伊红染液染色5min，随后冲片，苏木精染30 min，冲片，封片，镜检。根据各时期细胞学特征判断动情周期各个阶段。

1.2.2 免疫组织化学染色 小鼠脱颈椎致死，分别取出动情周期各阶段的卵巢与子宫，立即置于40 mL／L多聚甲醛中固定48h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为5μm。组织切片常规脱蜡至水，微波抗原修复后，在30mL／L H2O2中室温孵育30min，除去内源性的过氧化氢酶，ZF的克隆抗体（1∶400稀释）4℃过夜，其余步骤按免疫组织化学SP试剂盒说明操作，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。

2 结果

2.1 ZF蛋白在小鼠动情周期卵巢中的分布

ZF在各级卵泡的卵母细胞中均呈阳性分布，并且主要定位于胞质中（图1A～D）。原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞中未见ZF阳性染色，当卵泡发育至次级卵泡阶段时，颗粒细胞层中可见ZF蛋白的阳性分布；成熟卵泡的颗粒细胞中ZF蛋白的阳性分布更加明显。此外，在整个动情周期的黄体中均有ZF阳性分布，而在凋亡的颗粒细胞和各级卵泡的泡膜细胞中无分布。

图1 ZF蛋白在小鼠动情周期卵巢中的免疫组织化学定位（400×）Fig.1 Immunohistological localization of ZF in the ovaries of mice during estrous cycle（400×）

2.2 ZF蛋白在小鼠动情周期子宫中的分布

免疫组化结果表明，ZF在小鼠整个动情周期的子宫组织中都有分布（图2A～D）。ZF主要分布于子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞中，而在子宫间质细胞与子宫肌层中未见阳性染色。其中，ZF在间情期表达较强，发情期表达较弱。

图2 ZF蛋白在小鼠动情周期子宫中的免疫组织化学定位（400×）Fig.2 Immunohistological localization of ZF in the uterus of mice during estrous cycle（400×）

3 讨论

ZF作为CREB／ATF家族成员之一，在成人和胎儿组织中广泛表达［1］。近年来研究发现，ZF在哺乳动物的 UPR中起着重要的调节作用［5－8］。UPR参与介导了DDK综合症小鼠的胚胎早期死亡过程，在死亡胚胎细胞中GRP78与ATF4表达量显著增加［12］。而ZF可以和ATF4通过bZIP区域相互结合形成异型二聚体，通过调节其对DNA的结合能力或改变ATF4的转录活性，从而调整下游基因的表达［13］。饲喂高脂日粮的雌性小鼠其卵丘卵母细胞复合体（cumulus－oocyte complex，COCs）中ATF4和GRP78的表达量显著上升，同时伴随着排卵率及受精率的下降［14］。另外，ZF还可以和Luman，ATF6及XBP1等与UPR相关的bZIP蛋白相互作用。双敲除ATF6和ATF6β的小鼠其胚胎在发育的早期阶段发生死亡现象［15］。现有的试验结果均表明，UPR在生殖功能调节中具有重要作用。

颗粒细胞是组成成熟卵泡的最大细胞群，在卵泡发育过程中，颗粒细胞的增殖、分化对卵母细胞的发育成熟起重要作用。颗粒细胞通过缝隙连接，与卵母细胞进行自分泌和旁分泌的信息交流，为卵母细胞的发育提供营养物质，调节卵泡内的pH。卵母细胞指导了颗粒细胞的增殖、分化；同时颗粒细胞也影响卵母细胞的成熟和排卵［16］。ZF在小鼠卵巢中表达位置随动情周期卵泡的生长变化而变化，原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞中未见ZF蛋白分布，当颗粒细胞由两层增殖到多层时ZF蛋白的阳性表达明显增加；而在各级卵泡卵母细胞的胞质中均有ZF蛋白分布。此外，在整个动情周期的黄体中均有ZF阳性分布，而在凋亡的颗粒细胞和各级卵泡的泡膜细胞中无分布。推论ZF可能与卵巢中的类固醇激素合成有关，促进卵泡发育及确保优势卵泡和排卵后黄体的形成。

另外，一般认为，卵巢合成的类固醇激素调节着动情周期中子宫发生的一系列周期性变化。小鼠子宫内膜常伴随卵巢激素水平的改变而发生周期性的变化。动情前期血清中的雌激素水平开始升高，动情期达到峰值，到动情后期时出现下降，动情间期降至最低；孕酮水平则在动情后期达到最高，在动情间期迅速下降。卵巢类固醇激素的这种周期性变化调控子宫中许多基因的表达［17］。本试验结果表明，在整个动情周期中ZF广泛分布于小鼠的子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞中，这提示ZF在子宫内膜的免疫调节、腺体的分泌等方面可能发挥重要的作用。本试验仅对ZF在小鼠动情周期子宫与卵巢中的分布变化规律进行了研究，关于ZF在卵巢及子宫功能调控中的分子作用机制，还有待进一步研究。

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