桂林蛇源裂头蚴分离株的分子鉴定及种系发育关系分析

李雯雯，李 健，李树清，张鸿满，黄维义

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005；2.上海出入境检验检疫局，上海200135；3.广西疾病预防控制中心，广西南宁530021）

桂林蛇源裂头蚴分离株的分子鉴定及种系发育关系分析

李雯雯1，李 健1，李树清2＊，张鸿满3，黄维义1

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005；2.上海出入境检验检疫局，上海200135；3.广西疾病预防控制中心，广西南宁530021）

为研究从桂林草花蛇中分离到的裂头蚴的分子分类地位，对其核糖体18SrDNA、28SrDNA、ITS全基因及线粒体cox1部分基因进行了克隆和序列分析。从GenBank获取相应基因序列，应用CLUSTAL W2软件进行多重比对分析序列差异，应用MEGA 4.0软件构建种系发育树。结果表明，在基于18S、28S基因序列构建的种系发育树中，本株裂头蚴分别与欧猥迭宫绦虫（D64072）18S构成一个单独分支，自展值为100%；与拟曼迭宫绦虫（AF004718）、欧猥迭宫绦虫（AF004717）、无头蚴绦虫 （AF096223）28S同属一个分支，自展值61%。基于ITS1、ITS2和cox1部分基因序列构建的种系发育树与所有欧猥迭宫绦虫均构成同一亚群，总分支自展值分别为100%、99%、64%，三者在不同的分离株之间呈现基因多态性，从总分支自展值来看cox1比ITS更适合用于种内遗传多态性研究，ITS适合做定种的分子标记。

裂头蚴 ；小亚基；大亚基；内转录间隔区；细胞色素c氧化酶第I亚基

＊通讯作者

裂头蚴（Plerocercoid）是假叶目（Pseudophyllidea）裂头科（Diphyllobothriidea）绦虫蚴的总称。人类因食入含有活裂头蚴的鱼类或两栖类动物而引起的感染性疾病称为人裂头蚴病（Human plerocercoidosis）。其中，裂头科绦虫中以裂头属（Diphyllobothrium）及迭宫属（Spirometra）两类绦虫为主要的致病种。迭宫绦虫属至今共记载了超过10个种［1］，被公认为有效种的有欧猬迭宫绦虫 （S.erinaceieuropaei或S.erinacei）以及拟曼迭宫绦虫（S.mansonoides）［2］，前者呈世界性分布，后者主要分布于美国［3］。迭宫属裂头蚴寄生的宿主有蛇、蛙，成虫寄生于猫、狗等哺乳动物，人类也有感染迭宫绦虫成虫的病例报道。由迭宫属裂头蚴感染导致人裂头蚴病的病例，全球已报道有1 400例，其中以我国为最多［3］。由于南方饮食习惯中较为普遍的食用蛇、蛙等动物，这是人感染该病原的主要途径。鉴于人迭宫属裂头蚴病已成为重要的食源性寄生虫病，了解及掌握裂头蚴的种类与分布情况，对该病的有效控制和预防有着重要的公共卫生意义。

以从广西桂林市售草花蛇（Amphiesmastolatum）分离到的一株裂头蚴做为研究对象。经形态初步鉴定其应隶属于迭宫属绦虫后，通过对该株裂头蚴的核糖体小亚基（18SrDNA）、大亚基（28SrDNA）、内转录间隔区（ITS）全基因及线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基部分基因（pcox 1）进行PCR扩增测序，进行分子种系发育分析，旨在阐明这株裂头蚴的分子分类学地位，并为将来的分子诊断和分子流行病学调查提供分子标记。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体样品 2010年4月由广西疾病预防控制中心从桂林购买的草花蛇中分离收集，4℃保存于700mL/L乙醇。

1.1.2 主要试剂 rTaq酶、PCR 试剂、PMD18－T载体和DNA Marker DL 2 000均为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA提取试剂盒（DNeasy Blood＆Tissue kit）为QIAGEN公司产品；胶回收试剂盒为天根生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 酒精固定的虫体样本用去离子水反复清洗12h～24h，每隔2h换水1次。按照DNA提取试剂盒使用说明书提取裂头蚴虫体基因组DNA，将提取的基因组DNA置于－20℃保存备用。1.2.2 PCR扩增及克隆测序 18SrDNA基因扩增引物 根 据 文 献 ［4］设 计 ，PL2F：5′－ACCTGGTTGATCCTGCCAG－3′；PL2R：5′－CTTCCGCTGGTTCACCTACGG－3′。28SrDNA D1－D3基因扩增引物 根 据 文 献 ［5］设 计，PL3F：5′－TAGGTCGACCCGCTGAAYTTAAGCA－3′；PL3R：5′－GGAACCCTTCTCCACTTCAGTC－3′。ITS基因序列扩增引 物 自 行 设 计，18S－DF1：5′－ACTTGATCATTTAGAGGAAGT－3′； 28S－DR4： 5′－CTCCGCTTAGTGATATGCT－3′。pcox1基因引物根据文献［6］设 计 ，PL－cox1F：5′－TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT－3′； PL－cox1R： 5′－TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG－3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

反应体系25μL：2.5μL 10×buffer，2.5μL 25 mmol/L MgCl2，2.5μL 2.5mmol/L dNTP Mixtrue，10μmol/L引物各0.5μL，0.2μL 5U/μLTaqDNA聚合酶，2.5μL DNA模板，加无菌双蒸水至25 μL。18S与28S扩增程序：96℃预变性5min；96℃1min，44℃1min，72℃2min，5个循环；然后将退火温度升至48℃扩增25个循环；最后72℃延伸10min。ITS与pcox1扩增程序：95℃预变性5 min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。

PCR反应结束后电泳切胶回收，PCR胶回收产物与pMD18－T载体连接，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，增菌后送Invitrogen生物技术有限公司测序。

1.2.3 DNA序列数据的处理及分子系统树的构建

从GenBank获取已登录的所有裂头科绦虫的18 S及28S基因序列，迭宫属绦虫ITS基因序列、pcox1基因序列进行种间和种内对比。ITS序列信息如 下：S.erinacei（FJ886746－FJ886755）。pcox1序 列 信 息：S.erinacei（GQ999949－GQ999957，FJ886765－FJ886773， AB278573 － AB278575，AB369249 －AB369251， AB480297， AJ308259－AJ308265），Sparganumproliferum（AB015753）。应用Lasergene 6（SeqMan）对以上序列以及此次测序结果进行人工校对。18S及28S基因序列分别以圆叶目的扩展莫尼茨绦虫（Monieziaexpansa）（GU817405）和叶状裸头绦 虫 （Anoplocephala perfoliata）（AY569769）为外类群；ITS1、ITS2 及pcox1分别以裂头属绦虫（Diphyllobothrium）相应序列为外类群。应用Clustal W2在线软件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）进行多重序列比对后，利用 MEGA 4.0［7］用最大简约法（maximum parsimony，MP）与邻位相连法（neighbor－joining，NJ）分别构建50%多数一致树，自展值（Bootstrap values）重复1 000次。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

18S、28S基因PCR均扩增出了约2 000bp的片段，ITS大小约为1 300bp，pcox1约为450bp，均与预期的片段长度相符（图1）。

2.2 测序与系统发育关系分析结果

本株裂头蚴18S、28S、ITS、pcox1基因测序长度分别为2 172、2 242 、1 409、444bp。序列上传至NCBI获得登录号分别为 HQ228991，HQ228992，HQ228993和HQ699076。应用MP法与NJ法构建的50%种系发育树拓扑结构基本一致，仅在自展值有所差异，本文以NJ法为主进行系统发育分析。

基于18S构建的50%种系发育树（图2）中，裂头科中各个属基本各自构成一个群。本株裂头蚴（Spirometrasp.GL）与欧猥迭宫绦虫（D64072）构成一个单独分支，自展值为100%。基于28S基因序列构建的50%种系发育树中，由迭宫属、无头蚴属构成同一个大亚群，其中本株裂头蚴与拟曼氏迭宫绦虫（AF004718）28S、欧猥迭宫绦虫（AF004717）、无头蚴绦虫 （AF096223）同属一个分支，自展值61%。

基于ITS1与ITS2基因序列分别构建的50%种系发育树（图3）显示本株裂头蚴与所有的欧猥迭宫绦虫均处于同一个亚群内，自展值分别为100%和99%。两个亚群内均呈现多个分支。

基于pcox1基因构建的50%种系发育树（图4）中所有欧猬迭宫绦虫形成同一个亚群，自展值为64%。亚群内呈现两个主要的拓扑分支，自展值分别为53%与76%，其中本株裂头蚴与中国湖南黑斑蛙的裂头蚴分离株 （GQ999957、GQ999949、GQ999950），日本人源成虫分离株（AB480297、AB369250、AB369251），印 度 狗 源 成 虫 分 离 株（AB278574、AB278575），澳大利亚狐狸源成虫分离株（AJ308259），以及中国狗源成虫分离株（FJ886765、FJ886773）处于同一分支。

图1 Spirometrasp.桂林株18S、28S、ITS及pcox1基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 Analysis of PCR amplified 18S，28S，ITS and pcox1genes fromSpirometrasp.GL by agarosegel electrophoresis

图2 基于18S（A）和28S（B）基因序列以邻位连接法所构建的50%多数一致树Fig.2 A bootstrap 50%cut－off consensus tree inferred form 18Sand 28Sgene given in text using the Neighbor－Joining method

图3 基于ITS1（A）和ITS2（B）基因序列以邻位连接法所构建的50%多数一致树Fig.3 A bootstrap 50%cut－off consensus tree inferred form ITS1（A）and ITS2（B）gene given in text using the Neighbor－Joining method

图4 基于pcox1基因序列以邻位连接法所构建的50%多数一致树Fig.4 A bootstrap 50%cut－off consensus tree inferred form pcox1 gene given in text using the Neighbor－Joining method

3 讨论

由于裂头蚴的链体和生殖器官均未得到充分发育，无法运用传统的形态学鉴定方法进行有效的研究。通过感染终末宿主（犬、猫）将其培养至成虫，将耗费大量的时间，而且迭宫属绦虫成虫仅能依靠成熟孕节的子宫形状来区分S.mansonoides和S.erinaceieuropaei两个种［8－9］。分子生物学工具介入后，Lee S U等［10］比较观察了S.erinaceieuropaei与S.mansonoides的遗传距离，结果表明两者的种系发生具有相近的共同祖先和密切的演化关系。本文首先通过裂头科18S及28S两个基因的系统发育分析鉴定出本株裂头蚴隶属于裂头科迭宫绦虫属。

cox1基因序列与ITS基因序列常被运用于分子发育种间及种内研究。Zhu X Q等［11］基于pcox1基因进行多态性分析，发现在澳大利亚不同宿主分离的S.erinaceieuropaei至少存在2种基因型。Okamoto M等［12］的研究也发现了不同国家分离到的S.erinaceieuropaei种内存在不同基因型。本文所涉及的裂头蚴株在基于pcox1基因序列构建的种系发育树中，与Zhu X Q研究发现其中一个基因型处于同一分支，但相对于外类群，总分支的自展值仅有70%。在基于ITS1与ITS2分别构建的种系发育树中，呈现几个拓扑分支的现象，各分支的自展值较低，但仍可认为ITS基因同样在不同的分离株之间呈现基因的多态性，值得一提的是相对于外类群，总分支的自展值非常高，分别为100%和99%。由此我们可推断，在欧猥迭宫绦虫裂头蚴分子种系发育关系研究中，运用ITS基因序列有可能更适合于做定种的分子标记，而cox1更适合于做种内遗传多态性研究。

除了ITS与cox1基因序列是欧猬迭宫绦虫很好的分类鉴定的分子标记外，线粒体nad基因也是该种绦虫理想的遗传标记之一。刘自逵等［13］的研究表明，猬迭宫绦虫nad1比cox1基因序列的种间与种内差异要大一些，伍慧兰［14］在对猬裂头蚴nad 4基因的分析中也发现日本株和湖南株的pnad4的序列存在一定的差异。今后在裂头蚴种群关系的研究中，可以结合这几种基因，为虫株作精确的鉴定和分类，从而有效诊断和控制裂头蚴病的发生。

［1］ Schmidt G D.Handbook of tapeworm identification［M］.Boca Raton Florida：CRC Press，1986：675.

［2］ 裘明华，裘明德.人裂头蚴病和无头蚴病：Ⅰ.病原学的过去和现在［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2009，27（1）：54－60.［3］ 裘明华，裘明德.人裂头蚴病和无头蚴病：Ⅱ.病理学、临床、流行病学及控制的过去和现在［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2009，27（3）：251－261.

［4］ Medlin L，Elwood H J，Stickel S，et al.The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S－like rRNA－coding regions［J］.Gene，1988，71：491－499.

［5］ Littlewood D T J，Curini－Galletti M，Herniou E A.The interrelationships of Proseriata （Platyhelminthes：Seriata）flatworms tested with molecules and morphology［J］.Mol Phylogenet Evol，2000，16：449－466.

［6］ Bowles J，Blair D，McManus D P，et al.Genetic variants within the genusEchinococcusidentified by mitochondrial DNA sequencing［J］.Mol Biochem Parasitol，1992，54：165－74.

［7］ Kumar S，Nei M，Dudley J，et al.MEGA：a biologist－centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences［J］.Brief Bioinform，2008，9：299－306.

［8］ Iwata S.Experimental and morphological studies of Manson＇s tapeworm，Diphyllobothriumerinacei（Rudolphi）［J］.Prog Med parasit in Japan，1972，4：536－590.

［9］ Mueller J F.The biology ofSpirometra［J］.J Parasitol，1974，60（1）：2－14.

［10］ Lee S U，Huh S，Phares K.Genetic comparison betweenSpirometraerinaceiandS.mansonoidesusing PCR－RFLP analysis［J］.Korean J Parasitol，1997，35（4）：277－282.

［11］ Zhu X Q，Beveridge I，Berger L，et al.Single－strand conformation polymorphism－based analysis reveals genetic variation withinSpirometraerinacei（Cestoda：Pseudophyllidea）from Australia［J］.Molecular and Cellular Probes，2002，16：159－165.

［12］ Okamoto M，Iseto C，Shibahara T，et al.Intraspecific variation ofSpirometraerinaceieuropaeiand phylogenetic relationship betweenSpirometraandDiphyllobothriuminferred from mitochondrial CO1gene sequences［J］.Parasitol Int，2007，56：235－238.

［13］ 刘自逵，刘国华，戴荣四，等.湖南省猬迭宫绦虫的线粒cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析［J］.畜牧兽医学报，2010，41（4）：463－468.

［14］ 伍慧兰.猬裂头蚴线粒体nad4基因的克隆及序列分析［J］.动物医学进展，2010，31（12）：61－63.

Molecular Identification and Phylogenetic Analysis of Plerocercoid in Snakes from Guilin City

LI Wen－wen1，LI Jian1，LI Shu－qing2，ZHANG Hong－man3，HUANG Wei－yi1

（1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi，530005，China；2.ShanghaiEntry－exitInspectionand QuarantineBureau，Shanghai，200135，China；3.GuangxiCenterforDiseaseControlandPrevention，Nanning，Guangxi，530021，China）

To study the taxonomy position of plerocercoid from flower－waved snake in Guilin city，the nuclear 18SrDNA，28SrDNA，internal transcribed spacers（ITS）genes and the partial mitochondrial cyclooxygenase 1（cox1）gene of the plerocercoid were cloned，and the sequences analyzed.The corresponding sequences were downloaded from GenBank，and were aligned by the Clustal W2，and the phylogenetic trees were constructed by MEGA 4.0.The result showed that Guilin isolates and theS.erinaceieuropaei（D64072）18Swere clustered in the same clade based on the 18Sphylogenetic tree，bootstrap 100%.Guilin isolates were also in the same clade withS.mansonoides（AF004718）、S.erinaceieuropaei（AF004717），Sparganumsp.（AF096223）in 28S，bootstrap 61%，and in the same group with all ofS.erinaceieuropaeiITS1，ITS2and partial mitochondrial cox1gene sequences，the total branch bootstrap values were 100%，99%，64%.It showed gene polymorphism between different isolates in ITS and cox1，cox1is more suitable than ITS in studying intra－specific genetic polymorphism which considered from the bootstrap values，and ITS could be used as genetic marker for the species identification.

Plerocercoid；small subunit（18S）；large subunit（28S）；internal transcribed spacers；cyclooxygenase 1

S852.71

A

1007－5038（2011）10－0028－05

2011－04－01

国家质检总局科技专项（2010IK013）

李雯雯（1986－），女，广西南宁人，硕士研究生，主要从事寄生虫分子生物学及免疫学研究。