三聚氰胺对小鼠的急性毒性和蓄积毒性研究

林居纯，鄢荣梅，曹三杰，魏 峰，文心田＊

（1.四川农业大学动物医学院，四川雅安625014；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安652014）

三聚氰胺对小鼠的急性毒性和蓄积毒性研究

林居纯1，2，鄢荣梅1，曹三杰1，魏 峰1，文心田1＊

（1.四川农业大学动物医学院，四川雅安625014；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安652014）

为评价三聚氰胺的毒性作用，进行了三聚氰胺急性毒性和蓄积毒性研究。小鼠急性毒性试验设计为7个剂量组和1对照组，组间剂量比为0.65，每组10只小鼠，观察小鼠1周内的中毒表现，病理解剖及病理组织学变化，并计算三聚氰胺LD50及95%可信限。蓄积毒性试验以固定剂量（1/3LD50）连续染毒法，以蓄积系数评价其蓄积毒性。结果显示，小鼠三聚氰胺急性中毒主要表现为活动减少，呼吸急促，食欲降低等。小鼠死亡集中在染毒后42h～72h内。除肾脏外，小鼠肺、肝及脾均有眼观损害及组织病理学变化。三聚氰胺小鼠经口急性毒性 LD50为2 958.69mg/kg，LD5095%可信限为2 187.00mg/kg～3 981.07 mg/kg。蓄积毒性试验的蓄积系数为4。参照我国食品安全性急性毒性分级标准，三聚氰胺为低毒物质，有中度蓄积毒性，可造成肾、肺、肝及脾等内脏器官的损害。

三聚氰胺；急性毒性；蓄积毒性；小鼠

＊通讯作者

三聚氰胺（melamine）作为一种化工原料广泛用于塑料、涂料及黏合剂等生产。由于其含氮量高达66.7%，故被一些不法分子添加到乳品、饲料等中虚假夸大蛋白含量。继2007年美国报道宠物食品中掺杂三聚氰胺导致约4 000只猫、狗死亡以来，在其他国家和地区的饲料中也检出三聚氰胺［1］。2008年在我国超过5万名婴幼儿因食用含三聚氰胺奶粉而患尿路结石，6名婴儿死于肾衰竭［2］。三聚氰胺事件引起了全世界对三聚氰胺毒性的研究。急性毒性研究显示，三聚氰胺毒性作用靶器官是泌尿系统，对其他脏器未发现明显的损害［3］。有关三聚氰胺的蓄积毒性，以及在急性毒性试验中是否对其他脏器造成损害尚未见报道，为此本研究通过小鼠急性及蓄积毒性试验，观察三聚氰胺对小鼠内脏器官的损害作用，为长期毒性、特殊毒性研究和动物中毒治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明种小鼠，清洁级，健康，体重为18g～22g，雌雄各半，购自四川大学动物实验中心。

1.1.2 试剂 三聚氰胺（纯度≥98.5%）为成都市科龙化工试剂厂产品。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验 根据预试验结果得知，三聚氰胺小鼠灌胃0%及100%死亡剂量估量值分别为1 000mg/kg，15 000mg/kg。正式试验剂量组设为7组，组间剂量比为0.65。按体重随机分组法将小鼠分为8组，10只/组，雌雄各半。1组～7组为染毒组，第8组为蒸馏水对照组，灌胃染毒。染毒后记录1周内小鼠的中毒表现，死亡情况及病理学变化，三聚氰胺LD50及LD5095%可信限按改良寇氏法计算［4－5］。

1.2.2 蓄积毒性试验 按体重随机分组法将80只小鼠分为2组，40只/组，雌雄各半。试验组小鼠每天按1/3LD50的固定剂量连续灌胃染毒，对照组灌服蒸馏水。在试验期内观察记录动物死亡数，当试验组动物累计死亡达50%，结束试验。计算蓄积系数（K）＝LD50（n）/LD50（1），并对结果进行评价，其中LD50（n）为固定剂量引起受试动物半数死亡的累计剂量，LD50（1）为1次染毒引起动物半数死亡的剂量［4］。

2 结果

2.1 急性毒性试验结果

2.1.1 中毒表现及死亡情况 小鼠经口染毒6h后，表现为活动减少，精神萎靡，闭眼伏卧，呼吸急促，饮水量及采食量减少等症状。42h后最高剂量组小鼠发生死亡，随后各剂量组小鼠陆续死亡，死亡集中在染毒后42h～72h，耐过72h的小鼠不再死亡，但其精神状态较差，饮水量和采食量减少。对照组小鼠精神状态，摄食及活动未见异常，无死亡小鼠。三聚氰胺急性毒性试验小鼠死亡情况见表1。改良寇氏法计算三聚氰胺小鼠经口急性毒性LD50为2 958.69mg/kg，LD5095% 可 信 限 为2 187.00 mg/kg～3 981.07mg/kg。

表1 三聚氰胺急性毒性实验死亡动物数Table 1 Number of dead mice in acute toxicity test of melamine

2.1.2 小鼠病理学变化 中毒死亡及试验结束时存活的小鼠全部处死后做大体解剖，剖检可见小鼠肺脏表面有出血斑，部分小鼠肺脏萎缩，表面有白色结节；脾脏体积缩小，脾边缘有黑红色出血斑；肝脏肿大，肝表面有树枝状或细小长条形出血斑；肾脏肿大，充血出血。上述病变的严重程度随染毒剂量的降低而有所减轻。此外，第1组小鼠膀胱内有大量结石，输尿管有晶体沉积，随着剂量的降低，结石量减少，较低剂量组（第6、7组）小鼠膀胱内无结石，但可观察到结晶尿。其他器官未见眼观病变。

组织病理学检查发现所有染毒组小鼠肺脏、肝脏、脾脏及肾脏均有病理组织形态学变化，而对照组小鼠组织形态无异常变化。图1为1 690mg/kg染毒组小鼠组织器官的病理组织变化。

图1 三聚氰胺急性毒性试验小鼠病理组织学变化（HE）Fig.1 Histopathological lesions of mice in acute toxicity test of melamine（HE）

2.2 蓄积毒性试验结果

小鼠每天按986.33mg/kg（1/3LD50）染毒剂量连续染毒，当试验进行到第12天时，累计死亡小鼠数达总动物数的50%（20只/40只），而分次染毒累计剂量为4LD50，故三聚氰胺的蓄积毒性系数（K）为4。

3 讨论

2004年－2007年宠物饲料因污染三聚氰胺导致猫狗急性中毒主要表现为厌食、呕吐、嗜睡、多尿、氮质血症、高磷酸盐血症等肾病症状，动物最终死于尿毒症。死亡动物肾远曲小管损伤，远曲小管和集合管有扇形辐射状结晶沉积，肾小管上皮细胞发生坏死和增生［1］。啮齿类动物急性毒性研究表明，大鼠经口急性毒性LD50为3 161mg/kg［6］。小鼠急性毒性研究显示，20 000mg/kg剂量组小鼠给药9h后出现不安，呼吸急促，随后在几十分钟内发生死亡，其余组小鼠仅表现为精神不振，废食等。死亡小鼠输尿管有大量晶体蓄积，部分小鼠肾脏被膜有一层晶体，其他脏器未见有明显的变化［3］。

本试验经统计急性毒性试验小鼠死亡率，计算出三聚氰胺小鼠经口急性毒性LD50为2 958.69 mg/kg，LD50的95%可信限为2 187.00mg/kg～3 981.07mg/kg，与报道的大鼠 LD503 161mg/kg非常接近。据我国食品安全性急性毒性剂量分级标准［5］，三聚氰胺属低毒级物质。尽管三聚氰胺属低毒级，但其蓄积系数4，表明其在体内有中度蓄积毒性，说明三聚氰胺或其代谢产物能在机体内蓄积造成对机体的损害。

本次三聚氰胺小鼠灌胃急性毒性试验各染毒组小鼠均有食欲，饮水量减少，呼吸急促等中毒表现，与其他有关小鼠急性中毒症状相似［3］。小鼠病理剖检观察到小鼠肾脏肿大，表面有出血斑，并未观察到小鼠肾脏被膜有晶体存在，但在膀胱、输尿管发现结石或结晶，说明了泌尿系统是三聚氰胺的毒性作用的靶器官。急性毒性试验经3次重复试验，均观察到小鼠的肺、肝及脾有相似的病理变化，说明三聚氰胺除对泌尿系统有损伤作用外，对肺脏、肝脏和脾脏也有毒性作用。这是首次报道三聚氰胺经口急性毒性会造成对其他内脏的损害。

组织病理学观察显示各染毒剂量组均有形态学变化。肾脏主要表现为肾小球因毛细血管充血而增大，肾小管上皮肿胀，未观察到猫、狗急性中毒时的肾远曲小管和集合管的扇形结晶和小管上皮的坏死和增生［1］，以及亚急性毒性实验中观察到的猫、大鼠肾小管上皮坏死及管腔内的晶体［3，7－8］。可能的原因是本次试验甲醛固定病理组织材料时间过长，造成三聚氰胺及其形成结石溶解于甲醛［1］，故未能观察到肾小管内有晶体存在，只在远曲小管和集合管观察到深蓝色尿液。此外本试验还观察到肺、肝及脾有严重的充血出血，肺泡壁增厚，肝脏细胞颗粒变性等形态学改变，说明了肺、肝及脾脏也是三聚氰胺在体内的毒性作用的靶器官。有研究表明注射三聚氰胺对肝脏有毒性作用［10］，20d喂养试验表明，除对大鼠肾外，三聚氰胺对肝、脾、肺也有损害，表现出肝细胞水样变性及少量炎性细胞浸润，脾窦扩张、瘀血，以及局部肺泡间隔增宽，肺泡腔有少量的炎性细胞浸润［9］。

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Studies on the Acute and Accumulative Toxicity of Melamine in Mice

LIN Ju－chun1，2，YAN Rong－mei1，CAO San－jie1，WEI Feng1，WEN Xin－tian1，2

（1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Ya＇an，Sichuan，625014，China；2.KeyLaboratoryofAnimalDisease andHumanHealthofSichuanProvince，Ya＇an，Sichuan，625014，China）

To evaluate the toxicity of melamine to mice，the acute toxicity and the accumulative toxicity tests were carried out.The acute toxicity test was designed to 7experiment groups（r＝0.65）and 1control group，which consisted of 10mice.Toxic manifestations，gross lesions and histopathological lesions of mice，were observed during 7days acute exposure.LD50and 95%LD50confidence level of melamine were calculated by the modified Korbor method.The accumulative toxicity test was carried out by continuous exposure at a fixed dose（1/3LD50），the accumulative coefficient was calculated to appraise the accumulative toxicity of melamine.The acute toxic symptoms of mice were actively decreased，respiratory distress and anorexia.The death time of mice was within 42h－72h.Except for kidney，lung，liver and spleen of dead mice showed gross lesions and histopathological changes.The LD50of melamine to mice was 2 958.69 mg/kg，with 95%confidence interval of 2 187.00mg/kg－3 981.07mg/kg.The results of accumulative toxicity test showed that the accumulative coefficient K was 4.The results suggest that melamine is a kind of low toxic chemical according to food safety evaluation on toxicology in China，and possesses moderate accumulative toxicity in mice.The kidney，lung，liver and spleen are toxic targets of melamine in acute toxicity test.

melamine；acute toxicity；accumulative toxicity；mice

S859.8

A

1007－5038（2011）10－0047－04

2011－03－29

教育部"长江学者和创新团队发展计划"创新团队项目（IRT0848），四川省教育厅科研项目

林居纯（1968－），女，四川隆昌人，博士，副教授，主要从事药理与毒理学研究。