宁夏地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性分析

王桂琴，杨萌萌，邢 燕，尹力媛，刘 伟，冯若洋

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

宁夏地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性分析

王桂琴，杨萌萌，邢 燕，尹力媛，刘 伟，冯若洋

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

为了解宁夏地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的耐药情况，采用药敏纸片扩散法，测定了50株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对常用的17种抗菌药物的耐药性。同时采用产色头孢菌素法进行β－内酰胺酶的检测，并采用苯唑西林纸片法进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测。结果表明，所有菌株除了对利福平、万古霉素100%敏感以外，对其他15种药物均产生不同程度的耐药性，其中耐药率较高的有青霉素、氨苄西林、红霉素、头孢唑啉及克林霉素，耐药率较低的为阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、头孢噻肟及多西环素。50株金黄色葡萄球菌中，有25株产β－内酰胺酶，产酶率为50%，未检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

乳房炎；金黄色葡萄球菌；耐药性；β－内酰胺酶；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

奶牛乳房炎是微生物感染或理化刺激引起的一种奶牛乳腺炎症，是造成奶牛业损失最严重的疾病之一，全世界约有1/3的奶牛患有各种类型的乳房炎［1］。引起奶牛乳房炎的主要原因是感染病原微生物，可由多种病原菌共同或单独引起。迄今为止，人们已从奶牛乳房中分离到了150多种微生物，包括多种细菌、真菌、病毒、支原体等，其中金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要致病菌。现阶段国内外仍主要采用抗生素治疗乳房炎，但由于抗生素的大量使用及滥用，导致细菌产生耐药性而降低了疗效，而且使奶中抗生素的残留增加。

青霉素的问世曾使金黄色葡萄球菌感染得到强有效的控制，但随之产生的对抗菌药物的耐药问题，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin－resistantStaphylococcusaureus，MRSA）的出现，给临床治疗提出了新的挑战。MRSA不但对甲氧西林耐药，而且通常对所有β－内酰胺类抗菌药物及其他多种抗菌药物均有耐药性［2］，导致临床可选用的药物非常有限，由金黄色葡萄球菌和MRSA引起的疾病和死亡大大增加［3］。因此，监测其耐药性的变化可指导临床用药，避免抗菌药物的滥用，从而减少耐药菌株的产生。

宁夏地区奶牛业发展快速，但兽医临床上的不合理和滥用药物非常严重，这对治疗感染性疾病极其不利。因此，本研究对宁夏部分奶牛场乳房炎分离的金黄色葡萄球菌进行了体外药敏试验、筛选MRSA菌株和调查产β－内酰胺酶情况，以期为临床合理用药、预防和治疗乳房炎提供参考，促进奶牛养殖业的健康发展，并为乳房炎病原菌耐药机制的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 从宁夏地区部分奶牛场362份乳房炎奶样中分离的金黄色葡萄球菌。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923为中国药品与生物制品检定所产品。

1.1.2 抗菌药物药敏纸片 青霉素（10单位/片）、氨苄西林（10μg/片）、头孢唑啉（30μg/片）、头孢西丁（30μg/片）、环丙沙星（5μg/片）、氧氟沙星（5 μg/片）、诺氟沙星（10μg/片）、红霉素（15μg/片）、克林霉素（2μg/片）、阿米卡星（30μg/片）、四环素（30μg/片）、多西环素（30μg/片）、万古霉素（30 μg/片）、头孢噻肟（30μg/片）、利福平（30μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、复方新诺明（1.25μg/片）、苯唑西林（1μg/片），均为中国北京天坛药品与生物制品股份有限公司产品。

1.1.3 主要培养基及试剂 MH培养基、MH琼脂为北京奥博星生物技术有限公司产品；高盐甘露醇培养基为中国兽医药品监察所产品；β－内酰胺酶快速检测试剂盒为法国BioMerieux，sa公司产品；奶牛乳房炎诊断液 （Lanzhou mastitis test，LMT）为中国农业科学院中兽医研究所药厂产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 奶样采自宁夏地区不同规模、不同管理水平的6个奶牛场 ，乳房炎检测的方法和结果判定依据中国农业科学院中兽医研究所药厂生产的奶牛乳房炎诊断液产品说明书。乳房炎检测之后，采集隐性和临床型乳房炎的奶样。牛只按常规挤奶消毒后，每个乳头挤去头两三把乳后无菌取乳样5mL左右，贴好标签，4h内送检。

1.2.2 金黄色葡萄球菌的分离、鉴定 将采集的乳样涂于高盐甘露醇培养基上，37℃培养24h后，观察其菌落形态特征，挑取黄色的较小菌落于肉汤培养液中，培养24h后用微生物鉴定系统Microbial Identification System Version 6.1进行鉴定。

1.2.3 β－内酰胺酶的检测 在室温下将产头孢菌素纸片放置于培养皿中，用无菌蒸馏水浸湿纸片，然后沾取少量待检测菌菌落到纸片表面，原黄色纸片出现红色则为阳性结果，1h后如果无任何颜色变化仍为黄色的则为阴性。

1.2.4 金黄色葡萄球菌体外抑菌试验 按文献［4］推荐的纸片法进行，使用ATCC25923作为质控菌。试验结果判定标准按照美国临床检验标准委员会（CLSI）制定的标准执行，最后对数据进行统计处理。

1.2.5 MRSA菌株的检测 采用CLSI推荐的苯唑西林纸片扩散法，苯唑西林的含量为1μg/片，如抑菌环≤10mm为耐药，≥13mm则为敏感，11min～12mm为中间耐药。

2 结果

2.1 乳样中金黄色葡萄球菌的分离情况

本次试验共采集362份乳样，经微生物鉴定系统 Microbial Identification System Version 6.1鉴定，共鉴定出50株金黄色葡萄球菌，细菌分离率为13.81%。

2.2 金黄色葡萄球菌对17种抗菌药物的敏感性

50株金黄色葡萄球菌对临床常用的17种抗菌药物的耐药率情况见表1。由表1可以看出，分离菌对利福平、万古霉素的敏感性都达到了100%，对阿米卡星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、多西环素、头孢西丁及复方新诺明的敏感性都在85%以上。而对青霉素、氨苄西林、克林霉素、头孢唑啉、红霉素的耐药率达到了40%以上，其中耐药率较高的是青霉素、氨苄西林及红霉素。

表1 50株金黄色葡萄球菌对17种抗菌药物的耐药率Table1 The resistant rate of 50 Staphylococcusaureus strains to 17antimicrobial agents

2.3 金黄色葡萄球菌多重耐药分析

此次临床分离的金黄色葡萄球菌多药耐药情况比较严重，50株金黄色葡萄球菌中，除3株对17种药物都敏感外，其余菌株都有不同程度的耐药性，其中3耐的菌株有9株，所占比例最大，占所有菌株的18%，其次为6耐、5耐、4耐及7耐的菌株，所占比例分别为14%、14%、10%及4%。所有分离的多重耐药菌株中最多达到12耐（图1）。由图可见，7耐以上的菌株占18%，若同时耐3种药物即可归为多药耐药，那么50株金黄色葡萄球菌的多药耐药率为74%。

2.4 β－内酰胺酶的检测结果

采用产色头孢菌素法，对50株金黄色葡萄球菌进行β－内酰胺酶的检测，本次试验筛选出25株产β－内酰胺酶的金黄色葡萄球菌，产酶率为50%。

从表2可见，与β－内酰胺酶阴性葡萄球菌相比，β－内酰胺酶阳性菌表现多重耐药性。除万古霉素和利福平外，对其他的抗菌药均呈现不同程度耐药，其中青霉素G、头孢唑啉耐药率均为92%、氨苄西林为88%，红霉素、克林霉素为68%，卡那霉素为36%，其他的均在30%以下。

图1 金黄色葡萄球菌对17种抗菌药物的多药耐药情况Fig.1 Multi－drug resistance of Staphylococcusaureus to 17 antimicrobial agents

2.5 MRSA耐药表型鉴定结果

采用纸片扩散法对50株金黄色葡萄球菌进行MRSA的检测，以CLSI标准判读，本次试验未筛选出耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。

表2 β－内酰胺酶阳性金黄色葡萄球菌与阴性菌的耐药率Table 2 The resistant rate of Staphylococcusaureus strains producingβ－lactamase and negative strains

3 讨论

青霉素类和头孢菌素类均属于β－内酰胺类抗生素，本次试验选用青霉素类药为青霉素和氨苄西林。其中对青霉素产生耐药的有43株菌，占总菌株数的86%，对氨苄西林产生耐药的菌株数为36株，占总菌数的72%。这与史冬燕等［5］报道的金黄色葡萄球菌对青霉素和氨苄西林的耐药率分别为91.67%和65%相似。

本次试验结果显示，菌株对卡那霉素耐药率为26%，该结果与刘朝等［6］所报道的金黄色葡萄球菌对卡那霉素的耐药率为27.3%比较接近；菌株对阿米卡星的耐药率为6%，这与李乾学等［7］报道的金黄色葡萄球菌对该药物的耐药率为6%完全相同。结果表明牛源金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类抗菌药物的敏感性较高。

本次试验中，分离菌株对环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的敏感率均达到了85%以上，这与徐勤等［8］的研究结果很相近，这可能是因为宁夏在牛的疾病治疗中，氟喹诺酮类药物使用较合理，这类药物的耐药率与其他地区也很相近，敏感率较高。

本次试验检测到的金黄色葡萄球菌产酶株占50%，这比王冰等［9］报道的内蒙古呼和浩特地区金黄色葡萄球菌产酶率94.81%低很多，可见产酶株的发生在各地区存在差异，与各地区使用抗生素的情况不同有关。

耐甲氧西林葡萄球菌是重要的人畜共患病病原菌。它不仅是人类感染的重要感染菌之一，而且在多种动物上呈现出感染上升的趋势。目前在羊、猪、鸡、马、狗等动物，以及牛奶、肉类等食品中都分离到该病原菌。在一些国家和地区，人类感染耐甲氧西林葡萄球菌的比率较高，一般大于50%［10］，而动物感染耐甲氧西林葡萄球菌的比率变化很大，在0.18%～49%之间［11－13］。而本次试验未筛选出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，这与王教玉等［14］报道的鸡、猪的MRSA比例高达48.8%差异极大，这可能是由于动物异源性和临床用药差异而造成的，也说明了宁夏这几个奶牛场耐药情况还不是很严重。

［1］ 卜仕金，陈杖榴，冯淇辉.奶牛乳房炎的抗菌药物防治［J］.兽药与饲料添加剂，1999，4（3）：14－16.

［2］ 欧阳范献.MRSA的SCCmec分子分型及其耐药性研究［D］.海南海口：华南热带农业大学，2007.

［3］ 黄 怡.细菌耐药机制的研究现状［J］.国外医学：徽生物学分册，2000，23（1）：24－26.

［4］ CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；Fifteenth informational supplement：M100－S15［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，Wayne PA：USA，2005.

［5］ 史冬燕.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性及以黏附素为靶位的疫苗的基础研究［D］.内蒙古呼和浩特：内蒙古农业大学，2010.

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［7］ 李乾学，阎继业，邓旭明，等.吉林省动物源性金黄色葡萄球菌和链球菌的耐药性监测［J］.吉林畜牧兽医，2002（6）：7－8.

［8］ 徐 勤，巢国祥.生奶中金黄色葡萄球菌污染状况及耐药性状研究［J］.中国卫生检验杂志，2005，15（8）：972－973.

［9］ 王 冰，刘明春，吴聪明，等.呼和浩特地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的耐药性调查［J］.中国兽医杂志，2007，43（3）：30－32.

［10］ Lee J H，Jeong J M，Park Y H，et al.Evaluation of the methicillin－resistantStaphylococcusaureusscreen latex agglutination test for detection of MRSA of animal origin［J］.J Clin Microbiol，2004，42（6）：2780－2782.

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［13］ van Loo I H，Diederen B M，Savelkoul P H，et al.Methylicillin－resistantStaphylococcusaureusin meat products，the Netherlands［J］.Emerg Infect Dis，2007，13（11）：1753－1755.

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Resistant Analysis ofStaphylococcusaureusIsolated from Bovine Mastitis in Ningxia

WANG Gui－qin，YANG Meng－meng，XING Yan，YIN Li－yuan，LIU Wei，FENG Ruo－yang

（SchoolofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan，Ningxia，750021，China）

In order to find out the antimicrobial resistance ofStaphylococcusaureusisolated from bovine mastitis in Ningxia，were determined the antimicrobial resistance of 50Staphylococcusaureusstrains to 17 antibiotics by means of the methods of disk diffusion，and β－lactamase and methicillin－resistantStaphylococcusaureus（MRSA）were detected.The results showed that all strains were susceptible to vancomycin and rifampicin.The other 15antibiotics had different degrees of resistance，which had a high resistance to penicillin，ampicillin，erythromycin，cefazolin and clindamycin.The resistant rate was lower to amikacin，ciprofloxacin，ofloxacin，norfloxacin，cefotaxime and doxycycline.The isolates that secreted β－lactamase were 25strains，the rate of producing β－lactamase was 50%. Methicillin－resistantStaphylococcusaureuswas not detected.

mastitis；Staphylococcusaureus；antimicrobial resistance；β－lactamase；methicillin－resistant－Staphylococcusaureus

S858.23

A

1007－5038（2011）10－0059－04

2011－04－12

宁夏大学大学生创新试验项目资助

王桂琴（1970－），女，河北清苑县人，副教授，博士，主要从事细菌耐药性研究。