犬细小病毒和犬冠状病毒双重PCR方法的建立及应用

林 颖，耿庆华，付海滨，李俊环，闫明媚，李成镛，林书铭

（1.沈阳出入境检验检疫局，辽宁沈阳110016；2.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110161）

犬细小病毒和犬冠状病毒双重PCR方法的建立及应用

林 颖1，耿庆华1，付海滨1，李俊环1，闫明媚2，李成镛1，林书铭1

（1.沈阳出入境检验检疫局，辽宁沈阳110016；2.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110161）

根据GenBank中犬细小病毒（CPV）和犬冠状病毒（CCV）基因序列各设计了一对引物，经试验条件的优化，建立了检测CPV的PCR方法和CCV的RT－PCR方法，扩增目的片段大小分别为337bp和852bp。在此基础上建立了检测CPV和CCV双重PCR方法。该双重PCR方法能特异的扩增CPV和CCV，且分别扩增出1.08ng和3.2ng总核酸量。通过检测96份临床样品，对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明，建立的双重PCR方法快速、敏感、特异性高，可以用于CPV和CCV鉴别检测。

犬细小病毒；犬冠状病毒；双重PCR

犬细小病毒感染（Canine parvovirus infection）又称犬传染性出血性肠炎，是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的犬急性传染病。CPV基因组为单股负链DNA［1］，临床上多以出血性肠炎发生，如不及时治疗大多以死亡为终结［2］。犬冠状病毒性腹泻（Canine coronavirus diarrhea）是由犬冠状病毒（Canine coronavirus，CCV）引起的犬急性肠道性传染病，病毒核酸为单股RNA。CPV与CCV引发疾病的临床表现极为相似，且常发生混合感染，给鉴别诊断带来困难［3－5］。多重PCR技术是在同一PCR体系中加入多对引物，对多个目的基因同时进行扩增的分子生物学诊断方法，可同时检测多种病原体或多个基因型，达到对多种疾病的同步诊断，缩短检测时间［6－8］。本试验在单项PCR检测方法基础上，建立了双重PCR方法，即一次可同时快速鉴别诊断CPV和CCV两种病毒感染，为这两种疾病提供快速诊断方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和病料 美国富道四联弱毒疫苗（含犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒，简称美国疫苗），法国梅里埃六联弱毒疫苗（含犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体和犬黄胆出血群，简称法国疫苗），吉林五星五联弱毒疫苗（含狂犬病病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒，简称吉林疫苗）。犬冠状病毒，犬肾传代细胞（MDCK）由沈阳农业大学馈赠。病料为来源于12家动物医院临床病犬粪便样品，共96份。

1.1.2 试剂 DNA 聚合酶、dNTP、RT－PCR反应试剂盒、DNA Marker 100bp Ladder、胶回收试剂盒等均为宝生物工程（大连）有限公司产品；Ambian磁珠试剂盒为北京吉泰生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 从GenBank中分别获得5株CPV和2株CCV的全基因序列，利用生物软件CLUSTALX进行序列比较分析。用Oligo 6设计CPV和CCV特异性引物，扩增CPV引物P1和P2，可扩增片段为337bp；扩增CCV引物C1和C2，可扩增 852bp。序列为 P1：5′－AAG ACG TGC AAG CGA GTC C －3′；P2：5′－GAG CGA AGA TAA GCA GCG TAA －3′。C1：5′ －AGA TGT TGC GTG TAT TGG T －3′；C2：5′－CCG AAA GCA GTC ATT GGT AT－3′。

1.2.2 病毒核酸的制备 分别将接种CCV的犬肾传代细胞（MDCK）、美国疫苗、法国疫苗及吉林疫苗（吉林疫苗干粉加入1mL DEPC纯水，充分溶解）用Ambion的磁珠核酸提取试剂盒提取病毒核酸。

1.2.3 CCV RT－PCR和CPV PCR方法的建立

1.2.3.1 CCV RT－PCR方法的建立 采用20μL的RT反应体系，25mmol/L MgCl22μL，10×RT－PCR buffer 2μL，10mmoL/L的dNTP 2μL，反转录酶抑制0.5μL，10U/μL的反转录酶 AMV 0.5 μL，CCV下游引物1μL，瞬间离心后，于42℃水浴中反应30min。以反转录产物为模板的PCR采用25μL扩增体系，并对各反应条件进行摸索，PCR反应后，取5μLPCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3.2 CPV PCR方法的建立 以分别提取的美国疫苗、法国疫苗，吉林疫苗的核酸为模板，PCR反应采用25μL反应体系，并对各反应条件进行摸索，PCR反应后，取5μL PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3.3 PCR 产物的鉴定 CCV RT－PCR 和CPV PCR产物用胶回收试剂盒回收后，送宝生物工程（大连）有限公司进行测序。

1.2.4 CCV和CPV双重PCR方法的建立及产物鉴定 取法国疫苗及接种CCV的MDCK各25 μL，按照1.2.2方法提取核酸后进行反转录，20μL的RT反应体系，含25mmol/L MgCl22μL，10×RT－PCR buffer 1μL，10mmoL/L的dNTP 1μL，反转录酶抑制0.5μL，10U/μL的反转录酶AMV 0.5μL，CCV 下游引物0.5μL，瞬间离心后，置42℃水浴中反应30min。以反转录产物的cDNA和提取法国疫苗的核酸为模板进行双重PCR，PCR采用25μL扩增体系，并对各反应条件进行摸索，PCR反应后，取5μL PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳。将扩增产物经胶回收纯化试剂盒纯化后送宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.2.5 特异性检测 提取美国疫苗、法国疫苗、吉林疫苗、接种CCV的MDCK和正常的MDCK的核酸用建立的双重PCR方法扩增。

1.2.6 敏感性试验 取吉林疫苗和CCV细胞毒、吉林疫苗和CCV细胞毒混合物的核酸，提取后用分光光度计测定核酸浓度，取5μL核酸加入到45μL蒸馏水中，再从中取出5μL进行倍比稀释，依次为10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。分别做 PCR、RT－PCR和双重PCR。

1.2.7 双重PCR的初步应用及比对试验 对96份犬粪便样品采用CCV和CPV胶体金试纸条抗原检测方法进行检测和双重PCR方法进行比对试验。

2 结果

2.1 CCV RT－PCR扩增结果

经对反转录及PCR反应过程中的退火温度、延伸时间、循环次数等条件的优化，确定最佳反应条件。反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL、dNTP 2.5μL、上下游引物各0.5μL、Taq酶1μL、模板5 μL，去离子水补足25μL。PCR循环参数为：94℃预变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。反应产物扩增出特异性条带852bp，与预期结果相符（图1）。

2.2 CPV的PCR扩增结果

经对PCR反应过程中的退火温度、延伸时间、循环次数等条件的优化，确定最佳反应条件。反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL、dNTP 2.5μL、CCV上下游引物各0.5μL、Taq酶1μL、L、模板5 μL，去离子水补足25μL。PCR循环参数为：94℃预变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环后；72℃延伸10min。反应产物扩增出特异性条带337bp，与预期结果相符（图2）。

图1 CCV RT－PCR扩增结果Fig.1 The results of CCV RT－PCR

图2 CPV PCR扩增结果Fig.2 The results of CPV PCR

2.3 PCR产物的鉴定

CCV RT－PCR和CPV PCR反应产物用胶回收试剂盒回收后，送宝生物工程（大连）有限公司进行测序。结果与GenBank发表的基因序列同源性均在99%以上。

2.4 CCV和CPV双重PCR扩增结果及产物鉴定

经对PCR反应过程中的退火温度、延伸时间、循环次数等条件的优化，确定最佳反应条件，确定反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL、dNTP 2.5μL、CCV和CPV上下游引物各0.25μL、Taq酶0.5 μL、反转录产物的cDNA模板为3.5μL、提取法国疫苗毒的核酸模板1.5μL，去离子水补足25μL。PCR循环参数为：94℃ 预变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。反应产物电泳结果如图3。双重PCR产物电泳后，经胶回收纯化试剂盒纯化送至宝生物工程（大连）有限公司测序，扩增的2个条带测序结果分别与Gen－Bank上CPV和CCV同源性分别为99.3%和99.4%。

图3 双重PCR扩增结果Fig.3 The results of duplex PCR

2.5 特异性试验结果

提取美国、法国、吉林疫苗毒和CCV细胞毒的核酸，用CPV和CCV特异性引物进行扩增，结果表明均只扩增出CPV和CCV特异性条带，未出现其他条带（图4）。

图4 双重PCR特异性试验结果Fig.4 The specificity test results of double PCR

2.6 敏感性试验结果

提取吉林疫苗和CCV细胞毒核酸、吉林疫苗和CCV细胞毒混合核酸，用分光光度计测定提取的质量浓度为分别为2 160ng/μL和6 400ng/μL，取5 μL核酸加入到45μL蒸馏水中，再从中取出5μL进行倍比稀释，依次为00、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6，分别进行 PCR 和 RT－PCR。结果两种方法的敏感性均可达检测104的稀释度，分别相当于1.08ng和3.2ng总核酸量（图5、图6）。

图5 CPV敏感性试验结果Fig.5 The results sensitivity assay of CPV

图6 CCV敏感性试验结果Fig.6 The sensitivity assay results of CCV

2.7 双重PCR的初步应用及比对试验

96份临床病例粪便样品采用胶体金试纸条和双重PCR扩增方法同时进行检测（表1）。结果表明，建立的CPV和CCV双重PCR方法与商品化CPV和CCV抗原检测试纸条检测结果完全符合。且其中6份CPV阳性样品中同时扩增出了CCV，经测序与发表的CCV基因序列同源性为99.2%，表明该样品为两种病毒混合感染。同时也说明，在96份样品中，采用双重PCR方法CCV检出24/96，较试纸条方法的18/96检出率提高了7%。

表1 双重PCR与胶体金试纸条方法比对试验结果Table 1 The comparative detection of CPV and CCV in clinical samples using duplex PCRand colloidal glod strip

3 讨论

CPV和CCV是犬的两种急性传染病，均能引起急性出血性肠炎，在临床上二者很难鉴别诊断。本试验在CPV和CCV单项PCR基础上，通过对反应条件的优化建立了CPV和CCV双重PCR鉴别检测方法。敏感性试验表明，可以扩增1ng～10ng的总核酸量。用设计的CPV和CCV引物只能特异性扩增CPV和CCV，不能扩增犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体和犬黄胆出血群和正常的MDCK细胞，表明建立的方法具有很高的特异性。

用本试验建立的双重PCR方法检测了临床96份犬粪便样品，检测结果为CPV阳性78份，CCV阳性18份，这与胶体金试纸检测结果完全符合。且其中6份CPV阳性样品中同时扩增出CCV，经测序与发表的CCV基因序列同源性为99.2%。说明该6份样品为两种病毒混合感染。用建立的双重PCR方法即可用于CPV和CCV的检测和鉴别诊断，又可用于两种病毒的混合感染检测。在一个PCR反应体系中同时快速、准确地鉴定和区分CPV和CCV，提高了检测效率，同时又可将两者鉴别，具有很好的临床应用价值。该试验引入了磁珠法应用全自动核酸提取系统提取核酸，避免了以往病毒核酸的DNA和RNA分开提取的繁琐程序，更加适合大量的临床样品的检测。

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Establishment and Application of Duplex PCR for CPV and CCV Detection

LIN Ying1，GENG Qing－hua1，FU Hai－hua1，LI Jun－huan1，YAN Ming－mei2，LI Cheng－yong1，LIN Shu－ming1

（1.ShenyangExit－importInspectionandQurantinBureau，Shenyang，Liaonig，110016，China；
2.LiaoningAnimalDiseasesPreventionandControlCenter，Shenyang，Liaonig，110016，China）

One pair of PCR primer were designed according to sequence of Canine parvovirus（CPV）and Canine coronavirus（CCV）from GenBank respectively，which could amplify 337bp fragment for CPV and 852bp fragment for CCV.The products of PCR were proved to be specific.The sensitivity of PCR of CPV and CCV showed that the method could amplify 1.08ng and 3.2ng nucleic acid.The result of rudimentary application showed that the method was specific，sensitive，efficient，rapid，and was a new detecting method for the mixed infection of CPV and CCV，which also can differentiate CPV and CCV.

Canine parvovirus；Canine coronavirus；duplex PCR

S852.659.2；S852.659.6

A

1007－5038（2011）10－0071－04

2011－04－20

林 颖（1962－），女，辽宁沈阳人，高级兽医师，硕士研究生，主要从事预防兽医学研究。