喹乙醇及其主要代谢物在罗非鱼体内的药物动力学研究

陈永平，林黎明，张素青，李春青，李兆千

（1.农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心，天津300221；2.山东省出入境检验检疫技术中心，山东青岛26600）

喹乙醇及其主要代谢物在罗非鱼体内的药物动力学研究

陈永平1，林黎明2＊，张素青1，李春青1，李兆千1

（1.农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心，天津300221；2.山东省出入境检验检疫技术中心，山东青岛26600）

采用高效液相色谱－质谱法，研究肌肉注射给药方式下，喹乙醇及其代谢物在罗非鱼（Tilapiafish）体内的药物代谢动力学。罗非鱼注射给药20mg/kg后，其血浆、肌肉、肝脏中药物浓度－时间曲线关系符合一级吸收的二室开放动力学模型。喹乙醇在罗非鱼体内消除较快，在血液、肌肉、肝脏中的消除半衰期（t1/2β）分别为5.22、10.48和7.84h。总体清除率（CLs）分别为0.06mL/kg、0.02mg/（kg·h－1）和0.03mg/（kg·h－1）。喹乙醇代谢物3－甲基喹口恶啉－2－羧酸在罗非鱼肌肉和肝脏中药物水平的变化趋势与喹乙醇基本相似，但血液中并未检出。3种组织中喹乙醇平均峰值水平肝脏中最高、血浆中次之、肌肉中最低，喹乙醇在3种组织中的消除速率均较快。48h后3种组织中喹乙醇的浓度均降到安全限量（0.05mg/kg）以下，96h后基本消除。喹乙醇代谢物在肌肉、肝脏中0.25h达到最大浓度值，120h降到安全限量以下（0.02mg/kg），较喹乙醇代谢达到安全浓度需要时间长。

喹乙醇；喹乙醇代谢物；药代动力学；罗非鱼

喹乙醇（olaquindox）又名喹酰胺醇，商品名为快育灵、倍育诺等，为纯化学合成喹口恶啉类抗菌药，因其具有储氮作用，能促使氮代谢趋于正平衡，从而提高氮沉积和饲料，提高饲料转化率及利用率，促进鱼类生长及催肥，国内外广泛用作水产养殖动物饲料添加剂［1］。另外，该药具有广谱抗菌作用，对鱼类致病菌如革兰阴性菌、衣原体、螺旋体及放线菌等均有较好的抑制和杀灭作用，可治疗淡水养殖鱼类细菌出血性败血症、疖疮病等疾病［2－3］。然而由于喹乙醇大剂量、长期使用，导致养殖鱼类中毒，抗应激能力低下，出现“应激性出血”，并发生大量突发性死亡，给养殖生产造成了较大的损失［4－6］。关于喹乙醇毒性的研究，在家畜、家禽上已有较多报道［7－9］。研究发现喹乙醇具有致突变性、致癌性、生殖毒性等危害［10］，但对其在水产动物机体内的蓄积及其影响至今鲜有报道，以致人们仍存在侥幸心理，对喹乙醇的使用禁而不止，因喹乙醇添加而造成损失的事件仍时有发生。为了给水产养殖提供科学用药依据，本文对在常规养殖的罗非鱼进行肌肉注射喹乙醇，全面地了解喹乙醇及其代谢物在罗非鱼体内的药物动力学特征、残留及消除规律，同时为喹乙醇在其他水产动物中药代动力学比较研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 喹乙醇（OQX），为Siga公司产品，喹乙醇代谢物3－甲基－喹口恶啉－2－羧酸（MQCA）为CSS公司产品，乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）其余试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

pH8的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）：称取12g磷酸二氢钠和14.2g磷酸氢二钠，加水溶解，用1mol/L氢氧化钠调pH至8，加水定容至1000mL。

1.1.2 仪 器 和 设 备 Thermo Finnigan TSQ Quantum Access液相色谱－高分辨串联四极杆质谱联用仪，色谱柱为 AglientXDB C18（150mm×2.1mm i.d.，3.5μm）。配有ESI源，为美国 Thermo Fisher Scientific公司产品，氮吹仪，为美国Organomation Associates公司产品，离心机（10 000/rmin），旋 转 蒸 发 仪， 电 子 天 平（0.000 01g），为瑞士梅特勒－托利多仪器公司产品以及振荡器和0.45μm微孔滤膜等。

1.1.3 试验用动物 试验用罗非鱼（Tilapiafish），购自天津市水产研究所淡水站，体重100g～130g，抽样检查无喹乙醇（OQX）及其代谢物（MQCA）残留。

1.2 方法

1.2.1 分组 23℃～25℃暂养10d后用于试验，试验在6个水体，70L的方形塑料水箱中进行。试验分为2组，一组为空白对照组，另一组为试验组。每个缸放养罗非鱼15尾，根据罗非鱼体重注射相应体积的喹乙醇（浓度5mg/mL），每2d换水1/2体积。试验期间罗非鱼成活率为100%。

1.2.2 药饵注射给药 准确称量0.5g喹乙醇标准品，60℃～80℃蒸馏水定容至100mL，冷却后每尾鱼根据体重注射相应体积的喹乙醇（浓度5mg/mL），即给药剂量为20mg/kg体重，注射器采用普通2mL塑料注射器，单次给药，给药后5min开始取样。

1.2.3 采样时间 分别于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、144h采样，每次采样5尾。

1.2.4 血液样品采集 罗非鱼用抄网捞起，用干净纱布擦干鱼体，插入鳃下心脏取血，放入离心管（离心管事先放入0.3mL 10g/L的肝素钠），混合均匀后离心，取上层血浆，置于－18℃保存。

1.2.5 肌肉和肝脏样品采集 去除罗非鱼内脏、皮和骨骼等，取肌肉，切成5mm×5mm×5mm小方块，装入密封袋；将整个肝脏取出，装入离心管。肌肉和肝脏均置于－18℃保存，待药物残留分析。

1.2.6 药物残留分析

1.2.6.1 色谱条件 色谱柱：AglientXDB C18（150mm×2.1mm i.d.，3.5μm）；流动相∶乙腈∶甲醇∶1mL/L甲酸溶液＝8∶7∶85，梯度洗脱条件见表 1，流速200μL/min；进样量20μL；柱温：30℃。

表1 喹乙醇和喹乙醇代谢物梯度洗脱条件Table 1 Conditions of gradient elution for OQX and MQCA

1.2.6.2 质谱条件 离子化模式：电喷雾（ESI）离子源，正离子模式；电喷雾电压（is）为4 000V；离子传输管温度（TEM）为350℃；鞘气压力（GS1）：35Pa，辅助气压力（GS2）为5L/min；源内碰撞诱导解离电压为10V；扫描模式为选择反应监测（SRM）扫描方式，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2；Q1半峰宽为0.7Da；Q3半峰宽：0.7Da；碰撞气压力：氩气，1.5mTorr。

表2 喹乙醇和喹乙醇代谢物的质谱条件参数Table 2 LC－MS/MS parameters for OQX and MQCA

1.2.7 数据分析 药物在罗非鱼体内处置过程采用房室模型分析，药动学参数同时采用房室模型和统计矩原理来推算。模型的拟合和参数的推算采用药物代谢动力学软件3p97。

2 结果

2.1 高效液相色谱法－质谱法定量分析喹乙醇及其代谢物

配制质量浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0ng/mL喹乙醇及其代谢的混标溶液，流动相定容。测定结果采用外标法定量，喹乙醇代谢物标准的曲线方程为y＝97 513x＋95 250，相关系数R2＝0.999 8；喹乙醇标准的曲线方程为y＝79 695x－41 340，相关系数R2＝0.999 7（图1）。本试验在空白样品中添加OQX标准溶液，添加水平为1.0μg/kg，OQX的信噪比（S/N）大于10，表明OQX检测下限（LOD）可以达到1.0μg/kg；在空白样品中添加MQCA标准溶液，添加水平为0.5μg/kg，TCs的信噪比（S/N）大于10，表明MQCA定量下限（LOQ）可以达到0.5μg/kg。

图1 喹乙醇及其代谢物标准曲线图Fig.1 The curves of OQX and MQCA standard solution

2.2 喹乙醇及其代谢物在不同组织的回收率

以不含OQX和MQCA的罗非鱼、南美白对虾、梭子蟹为添加基质，分别添加4、10、40μg/kg浓度水平，每个浓度进行6次试验，测得本方法的平均回收率在75.7%～91.7%之间，喹乙醇及其代谢物回收率见表3，相对标准偏差（n＝6）在0.60%～4.7%之间。添加样品的总离子流图如图2所示。

表3 喹乙醇及其代谢物在罗非鱼肌肉、肝脏、血液中的回收率Table 3 The recoveries of OQX and MQCA in muscle，liver，blood of Tilapiafish

图2 空白罗非鱼肌肉加标（加标水平10μg/kg）（A）总粒子流图、喹乙醇（B）、喹乙醇代谢物（C）提取粒子流图Fig.2 The total ion and reconstructed ion chromatograms of blank Tilapiafish sample spiked 10μg/kg standard（A），OQX（B）and MQCA（C）

2.3 喹乙醇在罗非鱼体内脏器的药物代谢动力学参数

将实测的喹乙醇（OQX）及其代谢物（MQCA）平均药物浓度（Ci）－时间（Ti）数据输入计算机，应用3p97程序系统进行计算分析。进行F检验（P＞0.05或P＜0.01），取AIC值最小值房室数，一般情况下优化拟合度值越低越好。OQX及MQCA在罗非鱼肌肉、血液及肝脏的代谢采用一级吸收二室模型来拟合比较合适，OQX在血液、肌肉、肝脏中的相关性系数分别为（表4）0.991、0.993、0.996。拟合度（Goodness of fit）分别为0.12、0.23、0.24.。权重（Weight）均为1。AIC值分别为17.8、－2.0、0.97。MQCA在肌肉、肝脏中的相关性系数分别为0.93、0.97。拟合度（Goodness of fit）分别为0.33、0.27。权重（Weight）均为 1/C。AIC 值分别为6.288、1.756。药代动力学参数见表4。

2.4 肌肉注射给药后喹乙醇在罗非鱼体内脏器的代谢

罗非鱼肌肉注射相当于20mg/kg喹乙醇药液后，肌肉、血浆、肝脏中喹乙醇及其代谢物浓度－时间曲线分别如图3和图4。试验结果表明，罗非鱼经体内注射OQX后5min取样，血液、肌肉、肝脏含量即可达到9.94mg/L、7.24mg/kg、10.86mg/kg，C肝脏＞C血液＞C肌肉，肝脏中浓度值最高。随后在肌肉，肝脏中浓度迅速降低，给药2h后浓度为1.94mg/kg、3.03mg/kg，2h 后代谢速率减慢，72h后浓度降至安全值。血液中的OQX在0.5h内将维持较高浓度水平，0.5h～1.0h内浓度迅速下降，给药后1.0h～72h代谢速率较慢但总体浓度均高于肌肉及肝脏中浓度值。

表4 喹乙醇及其代谢物在罗非鱼体内的药代动力学参数Table 4 Pharmacokinetic parameters for OQX and MQCA in tissues of Tilapiafish

图3 注射给药喹乙醇在罗非鱼血浆、肌肉、肝脏中的药时曲线Fig.3 OQX concentration－time profile of plasma，muscle and liver following a single intramuscular injection

图4 注射给药喹乙醇代谢物在罗非鱼血浆、肌肉、肝脏中的药时曲线Fig.4 MQCA concentration－time profile of muscle and liver following a single intramuscular injection

2.5 喹乙醇代谢物（MQCA）在罗非鱼脏器内的代谢

喹乙醇代谢物在注射给药后肌肉和肝脏0.25h达到浓度最大值，浓度值分别为2.01mg/kg和2.90mg/kg，总体平均浓度C肝脏＞C肌肉，随后0.5h～4hMQCA浓度迅速下降，96h后肌肉、肝脏中的浓度值降到较低水平，浓度值分别为0.026 mg/kg和0.054mg/kg，血浆中并未检测到喹乙醇代谢物，推测可能喹乙醇被血液带到机体细胞内即可代谢，代谢产物同样被组织细胞代谢，未被代谢掉的MQCA与肌肉等组织的某些蛋白质结合，以致血浆中未被检出。

3 讨论

本试验利用罗非鱼作为试验对象，采用喹乙醇注射给药，高效液相色谱－质谱法分析喹乙醇及其代谢产物在其组织器官中的分布和残留情况。通过对喹乙醇及其代谢物浓度－时间曲线拟合，根据P值、最优拟合度、AIC等参数符合一级吸收二室开放模型。在其他种体内也有一室模型出现，如喹乙醇口服给药在鲤体内的药物代谢动力学［11］。由此可见，在不同物种、不同温度、不同给药方式下，其房室模型也不同。健康罗非鱼肌肉注射喹乙醇（相当于20mg/kg）后，血液、肌肉、肝脏中的分布半衰期（t1/2α）分别为0.20、0.30、0.34h，表明该药肌肉注射后吸收迅速，肌肉注射后0.083h，血药浓度为9.94 mg/L。血液、肌肉、肝脏中的消除半衰期分别为（t1/2β）5.22、10.48、7.84h，这和鲤鱼［11］中的喹乙醇消除半衰期（t1/2β）5.87类似，表明消除较快，体内滞留时间较短。血液、肌肉、肝脏中药时曲线下面积（AUC）分别为17.58、63.89、40.16μg/（h·mL－1），表明喹乙醇在罗非鱼体内的生物利用度较高。试验也证明，肝脏、肌肉是鱼类喹乙醇蓄积的主要代谢器官，其中尤以肝脏为主。这一结果与曾子建等［12］、孙永学等［13］报道的结果基本一致。肝脏中的喹乙醇在给药后1h～2h间有轻微的回升，这可能与水温的变化及鱼体中某些脏器对药物存在再吸收等因素的影响有关，也可能是肝肠循环“再吸收峰”所致［14－15］。

试验结果表明喹乙醇可以迅速代谢产生代谢，产物3－甲基喹口恶啉－2－羧酸（MQC A），在给药后0.25h就能达到药物浓度最大值，肌肉和肝脏分别为（Cmax）3.23、4.62mg/kg，表明喹乙醇代谢较快。随后MQCA逐渐降解，72h后肌肉和肝脏中的浓度值分别为0.101mg/kg和0.086mg/kg，消除半衰期分别为（t1/2β）25.52h和17.39h，表明消除速率比喹乙醇还要快。血样测定方案一将低温冷冻状态的血样解冻融化，12 000r/min高速离心，取上清过0.22μm微孔滤膜，上机，测定值为0，推测可能MQCA与其中的血红蛋白结合离心沉降底部所致。方案二将血样按碱水解提取方法，测定结果MQCA仍未检出。推测可能是喹乙醇在肝脏、肌肉组织细胞中代谢产生的MQCA直接与其内的某些蛋白质结合，并在其细胞内代谢降解，并未进入血液所致。整个试验结果表明，喹乙醇及其代谢物代谢速率较快，市场实际抽检水产样品表明，测定结果喹乙醇均为阴性（未检出），喹乙醇代谢物阳性检出率仅0.1%，这也为实施水产品中的喹乙醇及其代谢的监督检验提供了科学依据。但喹乙醇究竟是在哪几种组织代谢，代谢物MQCA与哪些蛋白结合需要进一步探索。

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Pharmacokinetics of Olaquindox and Its Metabolite inTilapiaFish

CHEN Yong－ping1，LIN Li－ming2，ZHANG Su－qing1，LI Chun－qing1，LI Zhao－qian1
（1.SupervisionandTestCenterforFisheriesEnvironmentandQualityofFisheryProductsofMinistryAgriculture，Tianjin，300221，China；
2.TheTechnicalCenterofShandongEntry－exitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao，Shandong，26600，China）

The pharmacokinetics，tissue metabolism and elimination of olaquindox（OQX）and its metabolite methyl－3－quinoxaline－2－carboxylic acid（MQCA）were investigated in Tilapia fish，after administration by single intramuscular injection of 20mg/kg.Plasma and tissue concentrations of olaquindox and its metabolite MQCA were simultaneously determined by a high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometric（LC－MS/MS）method.The concentrations versus time in plasma，muscle and liver from theTilapiafish were well described by a two－department open model with first－order absorption.Olaquindox eliminated quickly.The elimination half－life（t1/2β）in plasma，muscle，liver was 5.22，10.48，7.84hrespectively，and the total body clearance（CLs）was 0.06mL/（kg·h－1），0.02mg/（kg·h－1），0.03 mg/（kg·h－1），respectively.The metabolite MQCA concentration－time profiles of the muscle and liver presented similar trend.but Olaquindox did not detected in plasma.The peak residue of olaquindox was in liver，plasma and muscle.The eliminating rate of OQX from muscle and liver was very quick.The OQX concentration was eliminated below safe quantity（0.05mg/kg）after 48h.It was eliminated totally after 96h.The OQX level in musule and liver reached maximum at 0.25h，The MQCA concentration was eliminated below safe quantity（0.02mg/kg）after 120h.Time of OQX eliminated to safe concention requied longer compared with MQCA.

olaquindox；methyl－3－quin0xaline－2－carboxylic acid；pharmacokinetics；Tilapiafish

S859.7

A

1007－5038（2011）10－0054－05

2010－02－06

陈永平（1979－），男，山东临沂人，助理工程师，硕士，主要从事检测技术及药物代谢动力学研究。