喹硫平对小鼠脑缺血后胶质细胞增生及炎症反应的作用

房绍宽 吴 江 周春奎

(吉林大学第一医院神经内科,吉林 长春 130021)

脑缺血的临床表现不仅包括运动、感觉、视觉功能障碍,也包括遗忘、忽略等,而且常伴有情绪紊乱、抑郁焦虑及精神症状,这些均抑制脑缺血后生理和认知功能的恢复〔1～4〕。近几年,有证据表明一些非典型抗精神失常药具有神经保护作用。本研究以小鼠脑缺血为模型,研究非典型抗精神病药喹硫平是否对脑缺血具有保护作用,从而为深入研究非典型抗精神病药的神经保护作用机制,并对脑缺血的治疗提供有意义的资料,观察喹硫平对脑缺血后胶质细胞增生及炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择雄性 ICR小鼠(Charles River,St Constant,QC,Canada)46只,实验开始时重量 18～20 g,在正常饮食,正常光照时间,室温下饲养。

1.2 实验动物分组 见表 1,图 1。

1.3 给药方法 喹硫平(由英国Astra Zeneca制药公司提供)溶于无菌生理盐水中,参照文献〔5〕,缺血手术后给予小鼠喹硫平 10 mg/kg或盐水腹腔注射处理,1次/d,共 4w。

表1 实验动物分组

图1 实验动物分组

1.4 动物模型制备 用氯胺酮(110 mg/kg)和甲苯噻嗪(15mg/kg)麻醉,麻醉后沿腹正中线切口,分离双侧颈总动脉并用棉线阻断双侧颈总动脉血流 60 min后撤掉棉线观察血管血液复流,然后缝合腹正中线切口。假手术组执行相同程序,但不闭塞双侧的颈总动脉。手术后用热毯维持小鼠在正常体温。

1.5 实验方法

1.5.1 免疫组织化学方法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和中性粒细胞黏附因子(CD11)蛋白质表达 采用链霉卵白素-生物素-过氧化物酶(SABC)法,将组织切片置于 3%H2O2中常温处理 10min;蒸馏水洗涤 3次;加入血清封闭液 5 min;加入一抗(兔抗 GFAP和 CD11特异性抗体)37℃ 1 h;0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤 3次;加入生物素化二抗(羊抗兔IgG)37℃ 10 min;PBS洗 3次;加入 SABC试剂 37℃ 20 min;PBS洗涤 4次;二氨基联苯胺(DAB)显色;苏木素轻度复染,脱水封片镜检。

1.5.2 检测GFAP-IL-1β共表达 将组织切片在二甲苯中浸3次,正常山羊血清封闭,分别滴加 50μl的 1∶1混合的兔抗大鼠(1∶100)和小鼠抗大鼠白细胞介素(IL)-1β(1∶200),设空白对照(无一抗,加 PBS)和抗体特异性对照(加一抗不加二抗,加二抗不加一抗),所有切片同时染色。切片一抗加入后,置于湿盒内,4℃,过夜。激光扫描共聚焦显微镜观察。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件,数据资料以 x±s表示,采用两因素方差分析比较各组间的差异,应用t检验。

2 结 果

2.1 免疫组织化学染色结果 缺血组与假手术组比较脑缺血再灌后 2 h GFAP阳性细胞数量无明显变化;缺血组与假手术组相比较脑缺血再灌后 2 d和 4d、8d、2w、4w GFAP阳性细胞数量增加(P＜0.05);喹硫平加缺血组与缺血组比较 2 d、4 d GFAP阳性细胞数量无明显变化;8 d、2 w、4 w比较 GFAP阳性细胞数量明显减少(P＜0.05)。见图 2。

CD11是活化的小胶质细胞表面标志,缺血组与假手术组相比较脑缺血再灌后 2 h,2 d和 4 d CD11阳性细胞数量增加(P＜0.05);喹硫平加缺血组与缺血组比较各时间点 CD11阳性细胞数量无明显变化。见图 3。

2.2 激光共聚焦显微镜检测结果 缺血组与假手术组相比较脑缺血再灌后 4 w GFAP-IL-1β共表达阳性细胞(黄色)数量明显增加(P＜0.01);喹硫平加缺血组与缺血组比较 GFAP-IL-1β共表达阳性细胞(黄色)数量明显减少(P＜0.01)。见图 4。

图2 免疫组化检测脑缺血再灌后各时间点海马齿状回区GFAP表达的变化

图3 免疫组化检测脑缺血再灌后各时间点海马齿状回区 CD11表达的变化

图4 缺血再灌后 4 w GFAP-IL-1β海马齿状回区激光共聚焦显微镜观察(×400)

3 讨 论

脑缺血后反应性的胶质细胞增生活化包括早期的小胶质细胞的活化和后继的星形胶质细胞的活化。星形胶质细胞在维持神经元正常活性方面发挥几项重要作用,包括谷氨酸的摄取、释放,钾离子及氢离子的平衡缓冲以及水的转运。在正常生理情况下,小胶质细胞处于静息状态,分布于整个中枢神经系统(CNS)内。当脑部受到损伤或有病原体入侵时,小胶质细胞迁徙到病变部位并发生一系列结构和功能的变化,发挥吞噬细胞的作用。但过度增生活化的胶质细胞可以释放有害因子如肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1β、干扰素等导致迟发性神经元死亡(DND)。IL-1β可以通过刺激内皮细胞表达白细胞黏附分子,使白细胞聚集在缺血脑组织,引发炎症反应加重脑组织损害〔6〕。过度增殖的胶质细胞尤其是胶质疤痕的形成不仅可影响到神经元轴突的生长、突触的重建及阻断脑组织微循环〔7〕,而且还是脑血管病后癫痫发病的根源,因此胶质细胞对神经元的作用具有利弊双重性。抑制脑缺血后过度的胶质细胞增生及炎症反应成为脑缺血后神经功能重建目标的重要途径之一。

非典型抗精神失常药具有神经保护作用,基础实验提供了非典型抗精神失常药喹硫平可有效缓解 1-甲基-4苯基吡啶(MPP+)、H2O2及 β淀粉样肽等由于氧化应激所诱导的 PC12细胞死亡〔8,9〕。这些神经保护作用的机制包括影响Bax/Bcl-xl的转位和表达或 SOD-1的上调〔10～12〕。先前的动物实验结果表明喹硫平能有效缓解慢性应激导致的海马 BDNF和细胞增生的缩减〔13,14〕,而且喹硫平能有效缓解安非他明所诱导的行为学改变和对多巴胺神经末梢的毒性作用〔15〕。喹硫平在改善脑缺血后精神症状同时也减轻脑缺血后认知功能的损伤〔15〕。

前期的研究中发现颈总动脉闭塞(CCAO)能阻断 85%的脑血流并足以诱导小鼠神经元损伤而且死亡率仅有 5%,经过30、60、90min CCAO模型发现 60min CCAO在小鼠模型中产生明显的急性神经变性和记忆损伤〔16,17〕。因此本研究中,采用了60 min CCAO模型。

GFAP是星形胶质细胞中丝蛋白的主要组成部分,其表达量的增加通常被作为星形胶质细胞在 CNS损伤后活化和增殖的标志。本文应用免疫组化的方法检测脑缺血及给予喹硫平后海马齿状回内 GFAP阳性细胞表达,借以分析脑缺血后海马齿状回内星形胶质细胞增殖情况及喹硫平对脑缺血后星形胶质细胞增殖的影响。采用激光共聚焦显微镜观察方法评价脑缺血后的炎症反应及喹硫平对脑缺血后炎症反应的作用。本研究显示脑缺血再灌后2 d,4 d,8 d,2 w和 4w GFAP免疫组化染色阳性细胞数量增加,脑缺血再灌后 8 d,2 w和 4 w喹硫平减少 GFAP阳性细胞数量,抑制星形胶质细胞增殖和增生;脑缺血再灌后2h,2d和4 d CD11免疫组化染色阳性细胞数量增加,喹硫平对CD11的表达没有影响。缺血再灌后 4 w GFAPIL-1β共表达增加,同时喹硫平减少 IL-1-GFAP的共表达,从而减轻炎症反应。

本研究结果提示非典型抗精神失常药物喹硫平能够减轻脑缺血后星形胶质细胞的过度增生和活化同时减轻炎症反应为治疗缺血性脑损伤所伴发的精神紊乱提供新途径。

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