马勃菌丝体碳氮源利用的研究

孔 超 王丽华 宋爱荣

(山东省应用真菌重点实验室,青岛农业大学药用真菌研究所,青岛 266109)

马勃 (puff-ball),俗称牛屎菇或马蹄包,隶属担子菌亚门(Basidiomycotina)、腹菌纲 (Gasteromycetes)、马勃目(Lycoperdales)、马勃科。马勃种类繁多,分布广泛,在世界上大部分地区都有分布的记载。中国药典 (2005年版)[1]收载的马勃主要为脱皮马勃 (Lasiosphoera fenzlii Reich),大马勃[Calvatia gigantean(Batsch)Lloy]或紫色马勃 [C.lilacina(Mont.et Berk.)Lloyd]的干燥子实体。此外还有黄硬皮马勃、光硬皮马勃和地形科、灰包科等数10种马勃民间作为药用。

马勃为食药兼用真菌,最早记载于 《名医别录》,味辛性平,入肺经,有消肿、止血、解毒等功效,用于消除咽喉肿痛及各种出血症。李时珍的《本草纲目》中记载:“凡用以生布张开,将马勃于上摩擦,下以盘承取末利用”。原为野生,现可进行人工驯化栽培。

马勃的化学成分包括甾体化合物[2]、萜类化合物[3]、小分子含氮化合物、马勃多糖[4]、蛋白质、肽类、生物碱[5]等。马勃含有各种氨基酸[6],人体必需的8种氨基酸含量较高,特别富含赖氨酸、蛋氨酸,还含有马勃素、无机盐和微量元素等。

现代医学验证,马勃具有一定的药理作用和临床应用价值。马勃入药部位为子实体,相关的药理研究主要有以下几个方面:抑菌作用[7]、抗炎作用[8]、止咳作用[9]、止血作用[10]、杀虫作用[11]、抗肿瘤细胞作用[12]、抗增殖[13]和抗细胞分裂活性[14]、变态反应[15]、抗氧化作用[16]。

1 材料与方法

1.1 供试菌株 马勃464菌株,山东省应用真菌重点实验室保存。

1.2 供试培养基 母种培养基 (马铃薯加富培养基):马铃薯20%、麸皮1%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、琼脂 2%、水1L。

碳源培养基:马勃菌平板培养的碳源基础培养基配方为蔗糖2%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、琼脂2%、蒸馏水300 mL,pH自然。分别用葡萄糖、半乳糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、玉米面、玉米淀粉、地瓜淀粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉替换碳源基础培养基中的蔗糖,以不加碳源的培养基为对照。

氮源培养基:马勃菌平板培养的氮源基础培养基配方为 (NH4)2SO40.5%、蔗糖 2%、KH2PO4 0.05%、MgSO40.05%、琼脂2%、蒸馏水300 mL,pH 自 然。 分 别 用 NH4NO3、NaNO3、NH4Cl、NH4HCO3、NH4H2PO4、豆粉、麸皮、蛋白胨、尿素、玉米粉替换基础培养基中的 (NH4)2SO4,以不加氮源的培养基为对照。

1.3 试验方法 马勃菌固体平板培养法:按照无菌操作要求,挑取活化的菌种块约0.5 cm2接种于固体平板中央,封口标记。各处理设10个重复,采用内径为12mm的打孔器定量取种,在平板中心接种,置于25℃恒温培养箱中避光静置培养。从接种块萌发时开始记录,待菌丝长出原菌块后,每天采用 “十字交叉法”测量菌落直径,观察菌丝生长情况并记录菌落特征。待处理组的菌丝体长满平板直径时,结束该处理组培养。记录培养天数、菌丝生长情况等,并进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 马勃菌碳源利用的平板筛选

(1)不同碳源对马勃菌丝体日均生长量的效应。从表1可以看出,3号以甘露醇为碳源的处理,对马勃菌丝体日均生长量的效应明显,日均生长量为1.344 cm;其次是1号以玉米面为碳源的处理,日均生长量为1.310 cm;9号以可溶性淀粉为碳源的培养基对马勃菌丝体生长效应不明显,日均生长量仅为0.292 cm。12号不加碳源为对照,尽管日均生长量较大,为1.362 cm/天,但是菌丝体长势较差,表现为菌丝稀疏,灰白色,紧贴培养基。

从表1可以看出,可溶性淀粉培养基与其余碳源培养基存在极显著差异 (1%水平),其他各处理间差异不显著。

(2)不同碳源对马勃菌丝体长势的影响。从表1可以看出,以玉米面、甘露醇作为碳源的处理1、3,菌丝长势好;测量结束几天后继续观察,甘露醇菌丝体长势显著优于玉米面,表现为白色致密,绒毡状,铺满整个平板;其次为以马铃薯淀粉、地瓜淀粉、乳糖为碳源的处理6、7、8;可溶性淀粉作为碳源的处理9马勃菌丝体不生长。

表1 不同碳源的马勃菌丝体日均生长量及菌丝生长情况

在碳源试验中,以菌丝长满平板直径为标准,结束平板培养。观察各处理的菌落形态,其中,以麦芽糖、甘露醇处理的菌丝首先长满培养皿。

值得一提的是,本试验碳源培养基以蛋白胨作为氮源[17],因蛋白胨为复杂的天然有机物质,其中可能含有可充当碳源的营养成分,因此没有添加其他碳源的空白对照组菌丝体生长虽然稀疏,但仍较快。综合分析菌体生长速度和菌落形态,马勃菌丝体的单因子碳源试验结果以甘露醇为最佳。

2.2 马勃菌氮源利用的平板筛选

(1)不同氮源对马勃菌丝体日平均生长量的效应。从表2可以看出,11号以麸皮为氮源的处理,对马勃菌丝体日均生长量的效应较大,日均生长量为1.80625 cm;其次为12号以豆粉为氮源的处理、4号以NaNO3为氮源的处理,日均生长量分别为1.7375 cm、1.6975 cm;而5号以NH4Cl为氮源的处理及1号以 (NH4)2SO4为氮源的处理对马勃菌丝体日均生长量的效应较小,日均生长量分别为0.41735 cm、0.39625 cm。13号不加氮源为对照,尽管日均生长量 (1.70313 cm)较大,但是菌丝体长势较差,表现为菌丝体稀疏,白色,紧贴培养基。

各处理经差异显著性分析结果 (表2),以(NH4)2SO4作氮源的处理1与其他各处理存在显著差异。

表2 不同氮源的马勃菌丝体日均生长量及菌丝生长情况

(2)不同氮源对马勃菌丝体生长的效应。从表2看出,以NaNO3、尿素为氮源的处理,马勃菌丝体生长情况较好。当测量结束,继续培养2天后观察,发现后期NaNO3培养基菌丝体白色致密,绒毡状,铺满整个平板;尿素为氮源的,表现为菌丝稀疏,并渐变为灰白色。其余氮源培养基仍表现为生长缓慢,菌丝颜色与前期没有多大区别。

在氮源试验中,以菌丝长满平板直径为标准,结束平板培养。观察各处理的菌落形态,其中,以尿素、NaNO3处理的菌丝首先长满培养皿。

马勃平板培养特性氮源的选择试验结果显示,马勃菌丝体以NaNO3作为氮源生长得最好。差异显著性分析的结果显示,麸皮、豆粉、对照、NaNO3、玉米粉 、尿素 、蛋白胨 、NH4Cl、NH4HCO3、NH4NO3、酵母膏、NH4H2PO4、NH4Cl与(NH4)2SO4之间存在显著差异(5%水平);但各处理间无极显著差异(1%水平)。

3 讨论

根据本试验结果,马勃464菌株菌丝体生长的最佳碳源为甘露醇,最佳氮源为NaNO3。在试验过程中,由于对接种菌龄一致性、接种时菌块大小一致性和菌种接种部位的确定性等方面还会存在一些问题,难免会影响试验结果的准确性。本研究是在单因子条件下测试的碳、氮营养[18],而多因子的交互效应尚需进一步进行研究;试验方案设计的系统性也有待于进一步提高。

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