酶法测定血清游离脂肪酸的方法学评价及临床应用

李义龙,王 萌,唐志毅,韩靖云,黄桂玉

(卫生部北京医院 检验科,北京100730)

游离脂肪酸(FFA)是由油酸、软脂酸、亚油酸等组成,是甘油三酯的水解产物,大部分游离脂肪酸与血清白蛋白结合存在于血液中。血清中游离脂肪酸浓度受脂类代谢、糖代谢、内分泌功能等的影响。近年来研究发现FFA水平升高即可增加胰岛素抵抗又可引起高胰岛素血症[1]。大多数肥胖人群的2型糖尿病患者都存在胰岛素抵抗,而血浆游离脂肪酸(FFA)是联系肥胖和胰岛素抵抗或高胰岛素血症的重要环节[2]。目前测定血清FFA有滴定法,比色法,原子分光光度法,高压液相层析法,气相色谱法和酶法等。由于传统方法操作繁琐且精密度差,而日本积水医疗株式会社最新研制的酶法检测血清FFA试剂盒具有特异性高精密度好,操作简单并可直接用于自动生化仪检测。本文将FFA酶法试剂盒进行方法学评价,并对部分2型糖尿病患者进行FFA检测,结果如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集北京医院临床血清标本,按照FFA低、高2个水平制成混合血清,分装后于-80℃储存,用于不精密度测定;选择FFA高值样本用于线性分析。296例健康对照组:来自北京医院健康体检人员,男性164名,女性132名,用于参考范围的建立。123例2型糖尿病组。

1.2 试剂与仪器 FFA酶法试剂盒、校准物、质控及干扰物均来自日本积水医疗株式会社。仪器为日本日立7170A型全自动生化分析仪。

1.3 方法

1.3.1 酶法FFA的不精密度试验 参照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)颁布的EP5-A文件方案[3]进行操作。收集低高值2水平FFA混合血清。连续测定20天,每天测定两批,批间间隔的时间不少于2小时,每批对样品做双份测定,取均值,计算批内、批间、天间及总不精密度(cv%)。

1.3.2 酶法FFA的回收试验 (1)基础样本:向0.9 ml低浓度FFA血清样本中加入0.9%NaCl溶液0.1 ml;(2)回收样本:向0.9 ml低浓度FFA血清样本中分别加入浓度为 250、500、1 000 μ Eq/L 的FFA标准溶液各0.1 ml。混匀后重复检测2次,计算均值。公式为:P=(X1-X0)/M×100%,其中P为回收率,X1为混合样本的检测平均值,X0为基础标本浓度,M为添加的标准液浓度。

1.3.3 酶法FFA的干扰试验 参考NCCLS EP7-A2[4]文件方案进行操作:在健康人混合血清中各自添加一定量的维生素C、胆红素血红蛋白、脂肪乳,同时测定这些标本的FFA浓度,每个浓度测定2份,结果取均值,以干扰程度为10%作为该系统对干扰物的最高限。

1.3.4 最低检测限试验 参照NCCLS EP17-A[5]评价方案,用1 ml蒸馏水为空白标本进行检测,一次连续测定20次,对于离群的可疑值采用G检验方法进行验证。

1.3.5 线性范围测定 参照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)颁布的EP6-A[6]评价方案,用高浓度血清和低浓度血清,配置20个浓度梯度的溶液进行检测。每个浓度的标本同时测定2次,计算平均浓度。

1.3.6 参考范围设置 参照NCCLS C28-A2[7]评价方案,男性164名,女性132名,均为健康群体。

1.4 统计学分析 统计学分析采用Microsoft Excel 2003,SPSS 11.0软件。回归分析采用Passing-Bablok回归,回归线性检测采用Cusum方法检测,P＜0.05表示线性回归偏倚有统计学意义。相关性分析采用Pearson相关,P＜0.05表示相关具有统计学意义。偏倚分析采用Bland-Altman方法。

2 结果

2.1 酶法FFA的不精密度试验 检测低值和高值分别为486及981 μ Eq/L 2种浓度FFA血清的批间、批内和总的CV见表1。CV的合格标准根据卫生部临检中心室间质量评估允许FFA误差(25%)的1/4计算,因此CV应＜6.25%。根据表1可以看出批内 、批间、天间及总的CV 均 ＜6.25%,所以,酶法FFA试剂盒在检测486至981 μ Eq/L浓度时精密度较好,总CV均小于5.0%。

2.2 酶法FFA试剂盒回收试验 经计算3种不同浓度标准溶液的回收率分别为 98.0%、100.6%、103.7%,其回收率均在95%-105%范围内,该方法的回收率良好。

表1 酶法测定FFA的不精密度

表2 酶法 FFA回收试验(μ Eq/L)

2.3 酶法FFA的干扰试验 较高浓度的维生素C、溶血素、胆红素和乳糜对FFA测定值的干扰率均小于6%,即维生素C浓度＜500 mg/L、溶血素＜5 000 mg/L、胆红素＜400 mg/L和乳糜＜2.0%对FFA测定值均无明显干扰 。

2.4 最低检测限试验 测定FFA的最低检测限为26.2 μ Eq/L 。

2.5 线性范围测定 经测定结果显示Y=1.028X+12.2,R2=0.999 6,P＜0.05;R2=0.999 6说明检测值与理论值的相关性较好;b=1.028在0.97-1.03之间,说明斜率接近1;a=12.2说明截距接近0;P＜0.05说明所有偏移为抽样误差,因此当FFA浓度为35-1 780 μ Eq/L时线性良好,偏倚较小。

2.6 健康人群血清FFA参考范围 男女两组游离脂肪酸测定结果,分别经统计学处理,以±s表示,男性游离脂肪酸水平为:FFA 401.1±158.6 μ Eq/L;女性游离脂肪酸水平为:FFA 446.5±165.6 μ Eq/L,男女两组游离脂肪酸水平比较无显著性差异。统计分析后到出FFA的参考范围为96-740 μ Eq/L,与厂家提供的参考范围129-769 μ Eq/L基本一致。男性与女性比较P＞0.05无显著性差异。

2.7 FFA在2型糖尿病中的应用价值 2型糖尿病(2 DM)患者及对照组的 GLU、FFA、TC、TG 、HDLC、LDL-C测定结果。2型糖尿病组GLU、FFA、TC、LDL和TG升高明显,HDL降低,经统计学分析两组间生化指标具有显著性差异(P＜0.01)。2型糖尿病组中的GLU 与 FFA、TC、TG、HDL、LDL的相关系数分别为0.23,0.14,0.06,0.06,0.18。GLU和FFA的相关系数 r=0.23,显著性水平为0.027,小于0.05,因此,GLU与FFA显著相关。而与其它生化指标的显著性水平均大于0.05,与GLU的相关性不显著。由于在2型糖尿病组中的GLU与FFA具有显著相关,FFA极有可能是反映胰岛素抵抗的敏感指标。

3 讨论

游离脂肪酸(FFA)代谢正常与否在2型糖尿病糖代谢异常的发生、发展中起了十分重要的作用[1]。2型糖尿病的另一主要发病机制是胰岛β细胞分泌胰岛素的缺陷。高水平的FFA可以直接损害胰岛β细胞,最终发生与2型糖尿病相似的β细胞功能异常[8]。正确认识超重/肥胖患者胰岛素抵抗和β细胞功能异常的不同阶段中血清FFA水平的差异,有助于更好地理解FFA在疾病进展过程中所起作用。现已发现大多数肥胖人群都存在胰岛素抵抗,而血浆游离脂肪酸(FFA)是联系肥胖和胰岛素抵抗或高胰岛素血症的重要环节。肥胖的一个显著病理学特征就是脂肪细胞和脂肪组织体积增大。纠正FFA代谢异常对肥胖和2型糖尿病的防治有十分重要的意义[9]。

本文参照NCCLS EP文件对日本积水医疗FFA试剂盒进行精密度、线性范围、检测限、干扰及回收试验评估均取得良好的成绩。FFA分别为486及981 μ Eq/L 2种浓度的总CV均小于5.0%,最低检测限为26.2 μ Eq/L因此当FFA浓度为35-1 780 μ Eq/L时线性良好,偏倚较小。此试剂盒回收率较高均在95%-105%范围内并具有较高的抗干扰能力,维生素C浓度＜500 mg/L、溶血素＜5 000 mg/L、胆红素＜400 mg/L和乳糜＜2.0%对FFA测定值均无明显干扰。对296名健康查体人群血清的FFA分布作了研究,结果显示FFA的参考区间无性别差异参考区间为96-740 μ Eq/L。目前由于检测血清FFA方法大多都不成熟,存在许多缺陷,其参考方法为高效液相质谱法,此方法需昂贵的仪器和复杂的操作,由于实验室条件限制,故在方法学研究中未进行与其他方法比对,只是对FFA试剂盒的特性进行评价,包括不精密度、准确性、线性及抗干扰等可完全满足临床需要。本文对123例2型糖尿病人的部分血脂项目进行分析并与正常人作对照发现2型糖尿病人组的 GLU、FFA、TC、LDL-C和 TG升高明显,HDL-C降低,经统计学分析两组间生化指标具有显著性差异(P＜0.01)。2型糖尿病组中的GLU与FFA、TC、TG、HDL、LDL的相关系数分别为 0.23,0.14,0.06,0.06,0.18。GLU和FFA的相关系数r=0.23,显著性水平为0.027,P＜0.05,因此,GLU与FFA显著相关。而与其它生化指标的显著性水平均大于0.05,与GLU的相关性不显著。可见2型糖尿病组中的GLU与FFA具有显著相关。另外,FFA测定一定要注意尽快分离血清并及时进行检测,因血中含有各种脂肪酶存在,极易使TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA,使血中FFA值升高。贮存标本仅限于24 h内,若保存三天,其值约升高30%,血清于-80℃可保存3个月。

[1]Boden G,Chen X,Ruzi J,etal.mechanisms of fatty acids induced inhibition of glucose uptake[J].J Clin Endocrinol Metab,2001,86:2153.

[2]陈 江,姜东林,曹利民.β2型糖尿病患者血浆抵抗素和游离脂肪酸与胰岛素抵抗关研究[J].中国微循环,2006,10(1):523.

[3]NCCLS.EP5-A2:Evalution of precision performance of quantitative measurement methods;approved guideline-second edition[S].Wayne PA,2004.

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[5]NCCLS.EP17-A:Protocols for determination of dimits of detection and dimits of duantization;Approved Guideline-Second Edition[S].Wayne PA,2004.

[6]NCCLS.EP6-A:Evalution of the linearity of quantitative measurement procedures:A statistical approach;Approved guideline[S].Wayne PA,2003.

[7]NCCLS.C28-A2:How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory[S].Wayne PA,2000.

[8]McGarry JD.Banding lecture 2001,Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes[J].Diabetes,2002,51(1):7.

[9]李义龙,张 延,王 萌.肥胖人群的血清游离脂肪酸水平调查[J].中国实验诊断学2008,5(12):652.