前列腺癌与前列腺增生组织中P21活化激酶6的表达及意义

王新敏 章 乐 王勤章 丁国富 (石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，新疆 石河子 832000)

目前认为雄激素在前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)的发病中起重要作用，而雄激素受体是雄激素发挥作用的中心环节〔1〕。P21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是通过酵母双杂交识别出来的雄激素受体关联蛋白〔2〕，可参与雄激素受体的旁路调节。PAK6可与雄激素受体的配体结合域结合，是惟一已知的能与雄激素受体相互作用的PAK家族成员。但PAK6在PCa中的作用机制尚未完全明了。本实验采用免疫组织化学法和RT-PCR方法检测PCa和前列腺增生的组织中PAK6基因、蛋白表达情况，以探讨其与PCa发生和病理分级的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源 石蜡组织标本:收集新疆石河子大学医学院第一附属医院病理科1998～2008年PCa组织标本(n=70)及前列腺增生组织标本(n=20)。标本均经10%甲醛固定12～24 h后，常规石蜡包埋存档。其中高分化11例，中分化19例，低分化40例。新鲜标本:收集新疆石河子大学医学院第一附属医院2007～2008年PCa新鲜组织标本(n=10)及前列腺增生新鲜组织标本(n=10)，液氮保存。切片均经两位资深病理医生复查确诊。

1.2 主要试剂 PAK6多克隆抗体(IMGENGX公司，美国);Trizol(Invitrogen公司，美国);RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas公司);PrimeSTARTM HS DNA多聚酶(TaKaRa公司)。

1.3 免疫组织化学

1.3.1 SP法 石蜡包埋组织后4μm连续切片，常规脱蜡水化，PBS冲洗。高温修复抗原，冷却至室温，PBS冲洗2×3 min，滴加一抗，4℃孵育过夜。PBS冲洗3×5 min，滴加生物素标记的二抗。室温下孵育10 min，PBS冲洗3×3 min，联苯二胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

1.3.2 结果判断 以半定量积分法〔3〕判断每张切片PAK6的表达结果，以阳性细胞比例与显色强度计分。(1)染色强度:分为0～3级，阴性为0，无淡黄色及棕黄色颗粒，或阳性颗粒＜10%;弱阳性为1，淡黄或棕黄色颗粒占10% ～30%;中等强度为2，淡黄或棕黄色颗粒占30% ～60%;强阳性为3，淡黄或棕黄色颗粒＞60%。(2)阳性细胞比例:＜30%为1分，30% ～65%为2分，＞65%为3分。(1)+(2)两者相加为积分，用阳性系数大小表示蛋白质表达的高低:积分0～1者为阴性，2分为弱阳性，3～4分为阳性，＞4分为强阳性。

1.4 PAK6 mRNA表达

1.4.1 引物序列 所有引物由TaKaRa公司合成。β-actin(695 bp):5'-caccacaccttctacaatgagc-3';5'-gtgatctccttctgcatcctgt-3'。PAK6(315 bp):5'-caggtctttgtatgccactgag-3';5'-ggaggtctgctttcggtagag-3'。

1.4.2 RT-PCR 检测PAK6 mRNA表达取50 mg组织放入1.5 ml EP管中，加入1 ml Trizol，做组织匀浆，提取出总RNA，取2μl RNA样品，10 g/L琼脂糖凝胶电泳以观察所提RNA质量;取2μl RNA稀释至100μl，用紫外分光光度计测OD260、OD280值，以测定RNA纯度和浓度。贮存于-70℃备用。以定量的总RNA为模板，按RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒说明书逆转录合成cDNA;以合成的cDNA为模板，利用前述引物，分别对β-actin与PAK6进行PCR扩增，PCR反应条件:94℃预变性4 min后，进行 30轮循环(94℃ 45 s，56℃ 35 s，72℃ 30 s)，最后72℃延伸5 min。然后对PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.3 半定量结果分析 通过凝胶成像密度扫描系统测定各扩增条带的光密度积分值。结果采用Quatity One软件分析，以PAK6扩增条带的光密度积分与对应β-actin扩增条带的光密度积分之比值表示，并以此相对光密度积分值作为半定量指标，反映PAK6基因的相对mRNA水平。实验重复3次，以确保结果的可靠性。

1.5 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行χ2检验及Spearman等级相关分析;计量数据以±s表示，One-Way ANOVA方法对组间数据进行统计分析。

2 结果

2.1 PAK6在前列腺增生和PCa组织中的表达 20例前列腺增生的标本中 PAK6阳性率为70%(6/14)。70例 PCa中PAK6阳性率为 95.7%(3/67)，组间比较差异显著(χ2=11.429，P=0.01)。见表1。

2.2 PAK6在不同分化程度前列腺癌组织中的表达 高分化PCa组织由癌体排列、彼此分离的腺体构成，腺体中等大小，基本相似;中分化PCa组织分化中等，腺体大小不一，形态不规则;低分化PCa，腺腔结构基本消失，上皮细胞排列成实性片状、条索状;由高分化至低分化Pca，其PAK6染色强度逐渐增加。70例高、中、低分化PCa的PAK6表达阳性率逐渐升高，经Spearman等级相关分析，PCa的分化情况与PAK6的表达强度呈正相关性，相关系数为0.502，P＜0.01。见图1，表2。

2.3 RT-PCR结果 PAK6和β-actin在前列腺增生和PCa组织中均得到表达片段，分别为315 bp和695 bp。β-actin的条带表达较为均一，但PCa组织中的PAK6条带明显亮于前列腺增生组织。见图2。半定量结果分析表明，前列腺增生组织的PAK6/β-actinmRNA光密度之比为0.21±0.06，PCa组织的PAK6/β-actinmRNA光密度之比为0.74±0.07，两者有显著性差异(P＜0.01)。

表1 PAK6在前列腺增生和PCa组织中的表达(n)

表2 PAK6在不同分化程度PCa组织中的表达(n)

图1 PAK6在不同分化程度PCa组织中的表达(×400)

图2 RT-PCR检测PAK6基因在前列腺增生和前列腺癌组织中的表达

3 讨论

PAK是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶〔4〕。作为小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白，可被生长因子及其他胞外信号活化。PAK包括2个亚家族(PAKⅠ和PAKⅡ)，6个家族成员(PAK1～6)〔5〕。PAK1～PAK5参与调节细胞骨架、细胞生存、有丝分裂和血管生成等生物学功能，在肿瘤的发生、侵袭和转移过程中起着重要作用〔6〕。Ⅱ类PAK家族中的PAK6在激素信号转导中起重要作用〔7〕。PCa生物学特性非常复杂，目前对其演变过程及预后尚缺乏深入的了解。但可以肯定的是，雄激素及其受体与前列腺的发育和PCa的发生有密切关系〔8〕。而PAK6研究表明，PAK6能够与雌激素受体及雄激素受体相互作用并抑制雌激素受体及雄激素受体的转录激活作用。

PAK6作为惟一可与雄激素受体作用的PAK蛋白，在PCa中的作用机制尚未完全明了。PAK6可与雄激素受体的配体结合域上的氨基酸序列结合，更为重要的是激活的PAK6能抑制已受刺激的雄激素受体的核转位〔9〕。PAK6结合雄激素受体并与之共定位于细胞核内，抑制雄激素受体介导的基因转录〔10〕。这种抑制不是雄激素受体表达减少的结果，也不是PAK6对雄激素受体磷酸化减弱的结果，相反显示的是PAK6结合到雄激素受体上阻止雄激素受体结合转录激活剂的结果。PAK6与核受体的相互作用表明核激素受体与小GTP酶介导的信号传递途径有交互作用，推测PAK6可能参与PCa和乳腺癌等与激素相关的肿瘤的生物学行为。本研究通过免疫组织化学方法检测70例PCa和20例前列腺增生标本的PAK6表达，发现前列腺增生和PCa中PAK6均可以表达，但阳性表达率分别为70%和95.7%。由于石蜡组织的RNA保存不完好，提取较为困难，恐有漏检情况出现，因此，本研究收集了2007～2008年的新鲜组织样本，对其进行半定量RT-PCR检测PAK6 mRNA表达情况，结果与免疫组织化学检测结果一致。提示无论是在mRNA水平还是在蛋白水平上，PAK6在前列腺增生和PCa新鲜组织中均有表达，但表达程度不一样，PCa的表达水平明显高于前列腺增生组织，两者有显著性差异。免疫组织化学检测还发现，在不同分化程度的PCa组织中PAK6表达与PCa的分化等级明显呈正相关性，PAK6阳性表达率和表达程度随着恶性度的增高明显增加。这可能与PAK6与雄激素受体之间的信号转导通路有关。可能正是由于低分化PCa组织的雄激素表达大量增加，使PAK6分泌量增加，力图抑制已受刺激的雄激素受体进行核转位。增多的PAK6结合雄激素受体并与之共定位于细胞核内，抑制雄激素与雄激素受体结合介导的下游信号的传递。所以在低分化PCa细胞中，PAK6阳性表达增强，提示PAK6表达增强与PCa细胞恶性程度有关。因新鲜组织的PCa样本数较少，今后还应当进一步扩大样本数做更深入的研究。

本研究结果初步表明，PAK6可能参与了PCa与激素相关的肿瘤的生物学行为，并有助于明确PAK6在PCa发生发展中的作用，提示临床上若要全面阻断雄激素作用，除要阻断雄激素受体的信号外，还需抑制其旁路蛋白的激酶活性，为临床研究、诊断、治疗PCa提供新的思路。

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