结核病患者血清中Small RNAs表达谱分析

钟球 周琳 钱明 陈涛 陈亮 李海成

(广东省结核病防治研究所 广州 510630)

结核病患者血清中Small RNAs表达谱分析

钟球 周琳 钱明 陈涛 陈亮 李海成

(广东省结核病防治研究所 广州 510630)

目的了解结核病患者血清中Small RNA(sRNA)表达谱的特征,为从Small RNA角度探讨结核病发生、发展的调控机制奠定基础>。方法采用Solexa深度测序技术得到包括miRNA、siRNA 、piRNA 、rRNA 、tRNA 、snRNA 、snoRNA 、repeat associate sRNA 、exon 或 intron 降解片段等在内的所有Small RNA。通过与已知数据库进行比对、寻找样品与数据库之间在基因组位置上的overlap等方法,对sRNA进行注释,同时选取没有被注释上的 sRNA,使用华大自主开发的软件Mireap预测novel miRNA>。结果非结核病组血清中发现109 630种、2 759 795条Small RNA,其中候选miRNA种数为84、候选miRNA总表达量为1 433;结核病组血清中发现97614种、1 452119条Small RNA,其中候选miRNA种数为65、候选miRNA总表达量为755>。结论结核病人与非结核病人血清中的Small RNA表达谱存在种类与数量上的差异。

结核/血液;微 RNAs;基因表达

Small RNA是生物体内一类重要的特殊分子,在生物进化过程中高度保守。他可以诱导基因沉默,参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程,并已被证实参与和调控包括时序发育、细胞凋亡、神经元发育、激素分泌等在内的多种生理过程[1]。Micro RNA(miRNA)是目前研究最为广泛的一类内源性非编码单链小分子RNA,长度在22 nt左右[2-3],进化上高度保守。是真核生物基因表达中的一类负调控因子,通过碱基互补配对原则与靶基因mRNA结合,在转录后水平上使基因沉默,从而使mRNA降解或抑制mRNA翻译[4],也能在转录水平上通过决定目标基因染色体位点的甲基化而起作用。

检测周期长、高耐药率是结核病医务工作者面临的两大挑战。鉴于血清学诊断的简便、快速以及其在许多传染病诊断中所发挥的重要诊断作用,血清学诊断始终是结核病免疫学关注的焦点。但由于体液免疫与结核病发生、发展与转归的相关性仍不明晰,目前针对结核分枝杆菌各种抗原的抗体检测临床价值受限[5-6]。另辟蹊径寻找结核病血清学诊断标志物是当今热门课题之一。基于Solexa高通量测序技术的小 RNA数字化分析,采用边合成边测序(SBS-sequencing by synthesis),可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少,高通量,高精确性,拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点,一次性获得数百万条小分子RNA序列,能够快速全面地鉴定该物种在该状态下的小分子RNA和发现新的小分子RNA,构建样品之间的小分子RNA差异表达谱。本文利用Solexa高通量测序技术,分析非结核病组和结核病组血清中Small RNA表达谱的差异。为从血清Small RNA这个角度对结核病的发生、发展;耐药结核病的发生机制;结核分枝杆菌与机体的相互作用等方面进行研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 27例涂阳肺结核患者(下称“结核病组”,包括：男19例、女8例,年龄在 22～87岁之间,平均42岁)血清由广州市胸科医院提供,25例健康志愿者血清取自本单位职工(下称“非结核病组”,包括：男 11例、女 14例,年龄在 25～50岁之间,平均34岁)。

1.1.2 样本采集和保存 抽取静脉血4～5 ml置于2支真空促凝管中,室温静置约30 min,4 000转/min离心5 min,吸取血清均分至2支2 ml低温冻存管中,-70℃冰箱保存备用。

1.1.3 试剂与仪器 一次性真空促凝管购自广州阳普医疗科技股份有限公司;Total RNA Purification Kit(T RK-1001)为美国LC Sciences公司产品;从总RNA中分离sRNA、RT-PCR扩增、cDNA样品准备、DNA成簇扩增及测序等试剂使用Illumina公司配套产品;序列测定应用Illumina HiSeqTM 2000测序仪系统。

1.2 方法

1.2.1 血清总RNA提取 从-70℃冰箱取出每例备用血清样本1支,置室温待其溶解;从病例组、对照组的样本中各取1 ml血清按组别分别加至2支50 ml离心管中,制备病例组、对照组混合血清各1管;严格按LC Sciences RNA提取试剂盒说明书提取血清总RNA。

1.2.2 血清Small RNA测序 血清sRNA分离、纯化、cDNA文库建立、扩增与测序、生物信息学分析由深圳华大基因研究院协助完成,实验操作严格按照试剂和仪器说明书进行。主要实验流程包括：从总RNA中分离sRNA→5′接头连接→3′接头连接→RT-PCR扩增→sRNA文库的纯化→文库的检测→DNA在Cluster Station成簇扩增→Illumina HiSeqTM 2000测序仪上的测序→对10～30nt sRNA干净序列采用GenomeStudio软件进行生物信息学分析,得到两种人群血清中Small RNA的表达谱。

2 结果

2.1 数据质量及长度分析 非结核病组,有11 059 438条Small RNA序列被测定,其中高质量测序片断10 639 162条。将高质量的测序片段去接头、去污染后得到干净序列2 759 795条。结核病组,有10 174 571条Small RNA序列被测定,其中高质量测序片断9 732 428条。将高质量的测序片段去接头、去污染后得到干净序列1 452 119条。然后对干净序列的各种血清Small RNA进行表达分析,一般来说,Small RNA的长度区间为18～30nt,长度分布的峰能帮助我们判断Small RNA的种类,如miRNA集中在21或22nt,siRNA集中在24nt,piRNA集中在30 nt。2组人群血清中10～30nt的Small RNA的表达丰度见表1,其分布谱型见图1。

表1 不同长度(nt)血清Small RNA的表达丰度(%)

图1 2组人群血清中不同长度Small RNA的表达谱型图

表2 非结核病组血清中Small RNA在各类中的分布

2.2 Small RNA分类注释 将所有Small RNA与各类RNA的比对、注释情况进行总结。在以上各注释信息中,有可能存在一个Small RNA同时比对上2种不同的注释信息的情况。为了使每种Small RNA有唯一的注释,按照rRNAetc＞known miRNA＞repeat＞exon＞intron的优先级顺序将Small RNA遍历,没有比上任何注释信息的Small RNA用unann表示。由于 rRNAetc是由 NCBI Genbank和Rfam 2个数据库比对所得,规定这2个数据库间的优先级为Genbank＞Rfam[7]。分类注释结果中的rRNA总量可以作为一个样品的质控标准：一般情况下质量较好的动物样品中rRNA总量所占比例应低于40%。2组人群血清中Small RNA分类注释结果见表2、表3。

2.3 新miRNA前体预测及不同长度候选miRNA首位基因偏向性分析 miRNA前体的标志性发夹结构,能够用来预测新的miRNA。深圳华大基因研究院开发出了一套miRNA预测软件Mireap,通过对截取一定长度Small RNA比对上的基因组序列,探寻其二级结构及Dicer酶切位点信息、能量等特征,从所得到的Small RNA中筛选出有可能成为新的miRNA的片段,其统计结果见表4。不同长度的候选miRNA的首位点碱基分布统计分析见表5、表6,所有候选miRNA各位点碱基分布的统计见表7、表8。通过对不同长度的候选miRNA的首位点碱基分布及所有候选miRNA各位点碱基分布的统计,可根据已知miRNA的碱基偏好性的统计,对预测结果的准确性进行评价。

表3 结核病组血清中Small RNA在各类中的分布

表4 两种人群血清中新miRNA前体预测统计

表5 非结核病组血清中不同长度候选miRNA首位碱基偏向性

表6 结核病组血清中不同长度候选miRNA首位碱基偏向性

表7 非结核病组血清中候选miRNA各位点碱基分布的统计

表8 结核病组血清中候选miRNA各位点碱基分布的统计

续表8

3 讨论

Small RNA是生物体内一类重要的功能分子,它的功能是诱导基因沉默,调控细胞生长,发育,基因转录和翻译等生物过程。人们一般将其归为三类：微 RNA(miRNA)、小干扰 RNA(siRNA)和与PIWI蛋白相互作用的 RNA(piRNA)[8]。其中：miRNA是一种进化上高度保守、大小约20～25个碱基的单链小分子RNA,可通过调控基因表达等方式广泛参与机体的发育、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、免疫调节等过程[9];siRNA是一些双链的RNA在细胞内被特异地切割并加工成长度为21～25核苷酸的小分子 RNA,它能结合与之相似的mRNA分子抑制相应蛋白质的表达而致基因沉默[10];piRNA的长度为26～31个核苷酸,只存在于哺乳动物的睾丸中,推测与RNA沉默作用有关[11]。由此可见,Small RNA在生命活动中发挥着重要的作用。目前也有众多的研究显示Small RNA参与了许多疾病的病理过程,其中与肿瘤关系的研究更成为近年来生命科学的热点,它们与多种恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌等之间的关系被相继报道[12-14]。

循环系统中的Small RNA现在也进入了研究工作者的视线,张玉静等[15]报告分泌的miRNA能够以信号分子的形式调节细胞间的信息交流。在人血细胞和培养的THP-1细胞内,miR-150被选择性的包装成超微小囊,并且分泌活跃。THP-1起源的超微小囊能够进入并把miR-150传递给HMEC-1细胞。miR-150可以高效的降低c-Myb的表达并且加强HMEC-1细胞的移行。Mitchell等和其他2个工作组研究发现,循环miRNA有希望成为前列腺癌、妊娠、卵巢癌的生物学标记[16-18]。通过分析正常生理条件和其他各种疾病状态下血清中miRNA表达谱的特征,发现血清中的miRNA并不只来源于血细胞,也来源于受疾病直接影响的组织和细胞[19]。有意思的是血清来源的miRNA可以耐受RNaseA的消化作用,这与组织和细胞提取的RNA不同[19]。所以我们可以通过分析不同状态下人群血清中的miRNA表达差异,筛选出具有诊断意义的miRNA。同时这也是对细胞信号转导内容的补充。我们可以分析这些差异表达的miRNA出现的机制及其对机体的影响,从而使我们可以更详细的认识结核病,提供治疗结核病新的方法思路。

综上所述,结核病人群体内Small RNA表达谱发生了变化。这些差异表达的Small RNA可能通过调节对应靶基因而导致结核病发生发展及其转归、或者是与耐药结核病发生有关。本项目研究只是结核病人群血清中Small RNA表达谱的初步分析,这将为后续对研究Small RNA与结核病之间的关系奠定基础。

[1]Berezikov E,Guryev V,van de Belt J,Wienholds E,Plasterk RH,Cuppen E.Phylogenetic shadowing and computational identification of human micro RNA genes[J].Cell,2005,120(1)：21-24.

[2]Bartel DP.MicroRNAs：genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2)：281-297.

[3]Pasquinelli AE,Reinhart BJ,Slack F,Martindale MQ,Kuroda MI,Maller B,Hayward DC,Ball EE,Degnan B,Mǜller P,Spring J,Srinivasan A,Fishman M,Finnerty J,Corbo J,Levine M,Leahy P,Davidson E,Ruvkun G.Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA[J].Nature,2000,408(6808)：86-89.

[4]Kim VN.MicroRNA biogenesis：coordinated cropping and dicing[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2005,6(5)：376-385.

[5]Demkow U,Filewska M,Michalowska-Mitczuk D,Kus J,Jagodzinski J,Zielonka T,Zwolska Z,Wasik M,Rowinska-Zakrzewska E.Heterogeneity of antibody response to myobacterial antigens in different clinical manifestations of pulmonary tuberculosis[J].J Physiol Pharmacol,2007,58 Suppl 5(Pt1)：117-127.

[6]高孟秋,初乃惠,王海英,赵庆蓉,李华,高绪胜,罗涛.结核分枝杆菌特异性蛋白抗体检测在结核病诊断中的价值[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(12)：918-920.

[7]Calabrese JM,Seila AC,Yeo GW,Sharp PA.RNA sequence analysis defines Dicer's role in mouse embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(46)：18097-18102.

[8]Zhang C.Novel functions for small RNA molecules[J].Curr Opin Mol T her,2009,11(6)：641-651.

[9]Anglicheau D,Muthukumar T,Suthanthiran M.Micro RNAs：small RNAs with big effects[J].T ransplantation,2010,90(2)：105-112.

[10]Manjunath N,Dykxhoorn DM.Advances in synthetic siRNA delivery[J].2010,9(48)：418-430.

[11]T homson T,Lin H.The biogenesis and function of PIWI proteins and piRNAs：prog ress and prospect[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2009,25：355-376.

[12]Lu J,Getz G,Miska EA,Alvarez-Saavedra E,Lamb J,Peck D,Sweet-Cordero A,Ebert BL,M ak RH,Ferrando AA,Downing JR,Jacks T,Horvitz HR,Golub T R.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature,2005,435(7043)：834-838.

[13]Yanaihara N,Caplen N,Bowman E,Seike M,Kumamoto K,Yi M,Stephens RM,Okamoto A,Yokota J,Tanaka T,Calin GA,Liu CG,Croce CM,Harris CC.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prog nosis[J].Cancer Cell,2006,9(3)：189-198.

[14]Lowery AJ,Miller N,McNeill RE,Kerin MJ.MicroRNAs as prognostic indicators and therapeutic targets：potential effect on breast cancer management[J].Clin Cancer Res,2008,14(2)：360-365.

[15]Zhang Y,Liu D,Chen X,Li J,Li L,Bian Z,Sun F,Lu J,Yin Y,Cai X,Sun Q,Wang K,Ba Y,Wang Q,Wang D,Yang J,Liu P,Xu T,Yan Q,Zhang J,Zen K,Zhang CY.Secreted Monocytic miR-150 Enhances Targeted Endothelial Cell Migration[J].M ol Cell,2010,39(1)：133-144.

[16]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,Fritz BR,Wy man SK,Pogosova-Agadjanyan EL,Peterson A,Noteboom J,O'Briant KC,Allen A,Lin DW,U rban N,Drescher CW,Knudsen BS,Stirewalt DL,Gentleman R,Vessella RL,Nelson PS,Martin DB,Tewari M.Circulating microRNAs as stable blood-based markers fo r cancer detection[J].P roc Natl Acad Sci U S A,2008,105(30)：10513-10518.

[17] Gilad S,Meiri E,Yogev Y,Benjamin S,Lebanony D,Yerushalmi N,Benjamin H,Kushnir M,Cholakh H,Melamed N,Bentwich Z,Hod M,Go ren Y,Chajut A.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoS One,2008,3(9)：e3148.

[18]Resnick KE,Alder H,Hagan JP,Richardson DL,Croce CM,Cohn DE.The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel realtime PCR platform[J].Gy necol Oncol,2009,112(1)：55-59.Published online October 26,2008.

[19]Chen X,Ba Y,Ma L,Cai X,Yin Y,Wang K,Guo J,Zhang Y,Chen J,Guo X,Li Q,Li X,Wang W,Zhang Y,Wang J,Jiang X,Xiang Y,Xu C,Zheng P,Zhang J,Li R,Zhang H,Shang X,Gong T,Ning G,Wang J,Zen K,Zhang J,Zhang CY.Characterization of micro RNAs in serum：a novel class ofbiomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10)：997-1006.

Analysis of the expression profile for serum small RNAs from tuberculosis patients

Zhong Qiu,Zhou Lin,Qian Ming,Chen Tao,Chen Liang,Li Haicheng
(Guangdong Institute for Tuberculosis Prevention and Treatment,Guangzhou510630,China)

ObjectiveT o analyze the expression profile of serum small RNAs(sRNA)from tuberculosis(TB)patients,and find a new way to study the regulatory mechanisms in the process of tuberculosis.MethodsSmall RNAs from Solexa deep sequencing covered almost every kind of RNA,including miRNA,siRNA,piRNA,rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA,repeat associated sRNA and degraded tags of exon or intron.By comparing our sequences with those in databases and picking out the overlap on genome location between our data and the databases,sRNAs can be annotated into different categories.Those which can not be annotated will be used to predict novel miRNA by the self-developed software Mireap.ResultsIn the sera from non-TB patients group,109 630 different types containing 2 759 795 sequences of small RNAs were found,,in which there were 84 different types containing 1 433 sequences of miRNA candidates.In the sera from TB patients group,97 614 different types containing 1 452 119 sequences of small RNAs were found,in which there were 65 different types containing 755 sequences of miRNA candidates.ConclusionsThe expression profiles of serum small RNAs are different between TB patients and non-TB patients.

tuberculosis/blood;micro RNAs;gene expression

Zhong Qiu(gdtb_bg@vip.163.com)

钟球(gdtb_bg@vip.163.com)

1.广东省自然科学基金(9151051501000003);2.国家十一五重大专项：结核病发病模式的研究项目(2008ZX10003-007)。

2011-03-28)

(本文编辑：范永德)