RP-HPLC法测定天山雪莲口服液中绿原酸及芦丁

贾丽华， 凯赛尔·阿不拉

(1.新疆生产建设兵团医院，新疆乌鲁木齐 830002;2.新疆维吾尔自治区食品药品检验所，新疆 乌鲁木齐 830004)

天山雪莲口服液是以菊科风毛菊属植物天山雪莲(Sau-ssurea involucrataKar.et Kir.)Sch.-Bp.为原料，运用现代技术研制而成的纯天然单味口服制剂。本品收载于《国家中成药标准汇编》经络肢体脑系分册［1］，其测定方法为以芦丁作对照，用紫外分光光度法测定总黄酮量，缺乏专属性。文献报道天山雪莲中的紫丁香苷为其有效成分之一，其质量分数为0.232 mg/g［2］。曾经采用高效液相色谱法，对天山雪莲口服液中紫丁香苷的测定进行了研究，以进一步探索专属性较强的质量控制方法。然而天山雪莲口服液中紫丁香苷量较低，平均每1 mL 含0.03 mg［3］，不适宜作含测指标。天山雪莲药材主要含芦丁、槲皮素、高车前素、柯伊利素、木犀草素等黄酮类，大苞雪莲碱等倍半萜内酯类，挥发油类，还有绿原酸、紫丁香苷、多糖等成分［2-9］。高车前素、柯衣利素及大苞雪莲碱等无对照品可供用于测定。天山雪莲药材中绿原酸及芦丁的定量测定已收载于《中国药典》2005年版一部［5-6］，为保证天山雪莲口服液质量的可控性，采用HPLC法对其所含成分绿原酸和芦丁同时进行了测定，该方法简单易行，重复性好，可用于天山雪莲口服液的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪，包括Waters 1525双元高压泵，Waters 2487双通道紫外检测器，Waters 717自动进样器，Brezee色谱工作站;BP211D电子天平(赛多利斯公司);KLZ-UP高端超纯水机(台湾艾柯成都康宁实验专用纯水设备厂)。

1.2 试药 绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110753-200212供含量测定用)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号:0880-9705供定量测定用)。甲醇为色谱纯(Fisher公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。天山雪莲口服液(新疆天山雪莲制药有限公司，批号20040208， 20040628， 20040804， 20040921， 20050606，20050711，20050824，20050930)

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Symmetry shieldTMRP18(4.6 mm ×150 mm，5 μm，Ireland);以乙腈为流动相 A，0.4% 磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱;体积流量为1.0 mL/min，柱温为30 ℃;检测波长为340 nm［5］;进样:10 μL 测定。在以上色谱条件下，与其它组分分离度良好，见色谱图1。

表1 流动相洗脱程序

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取120℃减压干燥至恒重的芦丁，和绿原酸对照品各适量，加50%甲醇制成每1 mL含芦丁100 μg、绿原酸40 μg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品10 mL，置25 mL

量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，作为供试品溶液。

图1 绿原酸及芦丁对照品(A)和样品(B)HPLC色谱图

2.4 标准曲线及线性关系考察 精密称取绿原酸对照品10.19 mg及120℃干燥至恒重的芦丁对照品10.56 mg，置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇适量溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含绿原酸1.019 mg及芦丁1.056 mg的贮备液，精密吸取此贮备液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，制成每 1 mL 含绿原酸0.010 19、0.020 38、0.040 76、0.061 14、0.081 52、0.101 9、0.122 28、0.142 66 mg 及芦丁 0.010 56、0.021 12、0.042 24、0.063 36、0.084 48、0.105 6、0.126 72、0.147 84 mg的系列浓度对照品溶液，分别进10 μL，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积的积分值Y为纵坐标进行线性回归。各组分回归方程，相关系数，线性范围见表2。

表2 标准曲线

2.5 精密度试验 取绿原酸与芦丁混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积，结果绿原酸的 RSD为0.34%，芦丁的RSD为0.16%，显示精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一样品(20050930)，按2.3项下的方法分别制备6份供试品溶液，按测定法进行测定，结果绿原酸，芦丁质量浓度分别为 0.106 mg/mL，0.289 mg/mL，RSD分别为1.66%，1.73%。结果表明，该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(20050930)，分别放置 0、4、8、12、16 h 后进样，每次 10 μL，测定峰面积，结果绿原酸和芦丁RSD分别为1.23%、0.14%。表明供试品溶液室温在16 h内稳定。

2.8 回收率试验 取已测定的(20050930)样品共9份5.0 mL，每份按高、中、低分别加入各对照品溶液，按2.3项下操作，计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收实验

2.9 样品测定 取8批天山雪莲口服液，按2.3项下的样品处理方法及2.1项下的色谱条件进行测定，每批样品平行制备2份，每份进样2次，每次进样10 μL，结果见表4。

表4 样品测定结果(n=4)

3 讨论

3.1 本实验曾参考中国药典2005年版一部天山雪莲药材［5］项下HPLC中的流动相系统，不能同时满足芦丁和绿原酸的分离，而在本实验条件下绿原酸和芦丁的分离度良好。

3.2 流动相选择试验中比较了甲醇-0.4% 磷酸溶液(38∶62，35 ∶65)，乙腈-0.4% 磷酸溶液(13 ∶87，15 ∶85)等，发现绿原酸、芦丁和相邻杂质分离度不佳，以乙腈-0.4% 磷酸溶液进行梯度洗脱，达到完全分离。因此最终确定进行梯度洗脱。

［1］国家药品监督管理局编.国家中成药标准汇编.经络肢体脑系分册［S］.2002:560-563.

［2］俞敏倩，陈建民.高效液相色谱法测定11种雪莲花中芦丁及紫丁香苷［J］.色谱，2001，19(3):243-244.

［3］凯赛尔·阿不拉，苏来曼·哈力克，王新宇.HPLC测定雪莲口服液中紫丁香苷的含量［J］.中国中药杂志，2006，31(22):1895-1897.

［4］李君山，蔡少青.雪莲花类药材的化学和药理研究进展［J］.中国药学杂志，1998，33(8):449-452.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部［S］.北京:化学工业出版社，2005:36-37.

［6］苏来曼·哈力克，凯赛尔·阿不拉.RP-HPLC测定不同产地不同采集期天山雪莲中绿原酸和芦丁的含量［J］.中草药，2007，38(9):1412-1414.

［7］欧 元，袁晓凡.天山雪莲HPLC指纹图谱研究［J］.中草药，2008，39(1):105-108.

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［9］张富昌，赵文军.新疆雪莲的超临界萃取及气相色谱-质谱分析［J］.时珍国医国药，2007，18(8):1821-1823.

［10］陈发奎主编.中药有效成分含量测定［M］.北京:人民卫生出版社，2007:11.

［11］刘晓秋主编.中成药分析实验［M］.北京:中国医药科技出版社，2006.